[发明专利]一种用于抑制虾、牡蛎18SrDNA序列特异性扩增的引物及其应用

说明书

本发明公开了一种用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物，所述的引物主要由如SEQ ID NO.1所示的碱基序列、在所述碱基序列AG之间插入的五个脱氧次黄嘌呤、以及在所述碱基序列末端的C3 spacer组成。该引物能够有效抑制宿主基因的扩增，提高宿主体内其它真核生物(如原生动物、藻类、真菌)18S rDNA的扩增效果。本发明还公开了上述引物在制备具有抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增功效的试剂中的应用。

技术领域

本发明属于PCR引物技术领域，具体涉及一种用于抑制虾、牡蛎18S rDNA 序列特异性扩增的引物及其应用。

背景技术

真核动物宿主(如牡蛎、虾)的基因组中含有18S rDNA基因序列。同时，其体内(如肠道)也携带有多种真核微生物(如尚未消化的藻类食物、内共生真菌、寄生虫)，它们基因组中也都含有18S基因序列，不同物种间的18S序列有一定相似性。

为了对宿主体内存在的真核微生物进行研究，人们通常采用PCR的方法通过 18S基因的通用引物进行特异性扩增。但是，由于不可避免的大量宿主自身18S 基因序列的干扰，使得这样扩增后产物中宿主18S序列占据了绝大部分的比例，影响了研究结果。

抑制引物是根据真核宿主及真核微生物的18S rDNA的基因序列特征设计的一种特异性抑制宿主基因扩增的引物。通过添加抑制引物，能够有效降低宿主基因序列的扩增效率，提高宿主体内其它真核生物(如原生动物、藻类、真菌)18S rDNA的扩增效果。

但是现有技术中还没有用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物，该引物能够有效抑制宿主基因的扩增，提高宿主体内其它真核生物(如原生动物、藻类、真菌)18S rDNA的扩增效果。

本发明的目的还在于提供上述用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物在制备具有抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增功效的试剂中的应用。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于抑制虾、牡蛎18SrDNA序列特异性扩增的引物，所述的引物主要由如SEQ ID NO.1所示的碱基序列、在所述碱基序列AG之间插入的五个脱氧次黄嘌呤、以及在所述碱基序列末端的C3spacer组成。

该引物(简称：nmb-BP2-DPO)具体为：

GTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTCTA44444(4代表 dlnosine)GTGAGGGCAC(C3spacer)。

本发明的关键是设计一种对宿主18S基因扩增具有很好抑制效果的，同时又对其它微生物的18S基因扩增抑制很小的引物序列。

本发明的研究过程中设计了多条不同的抑制引物，并确定了两种最有希望的设计方案，一种称为C3间隔子，抑制引物的5’端与通用引物的正向或反向3’端有重叠(部分或全部)，然后以宿主序列延伸且3’端以化学修饰(C3spacer) 结束；另一种称为双引发寡核苷酸，同C3间隔子设计相似，主要是中间含有五个脱氧次黄嘌呤(dlnosine)连接5’端和3’端。为了验证这些候选抑制引物的抑制效果，以不添加抑制引物的做为对照组，以添加抑制引物的作为检验组，通过琼脂糖凝胶电泳，验证了各种抑制引物的抑制效果。最后通过筛选确定了双引发寡核苷酸引物。