[发明专利]一种去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法

说明书

本发明提供了一种去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法，包括：对胰岛素前体使用胰蛋白酶进行酶切；将二价金属离子加入到酶切后的反应体系中；调节反应体系的pH值至反应产物的等电点附近；收集获得的沉淀，酶切条件为30℃，1～2h，二价金属离子为具有水溶性的二价金属离子，包括Ni²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺和Mn²⁺，二价金属离子与胰岛素前体的摩尔比为0.5:1～4:1，pH为4.0～6.0，沉淀温度为0～30℃，沉淀时间为0～12h。使用本发明所提供的方法，不需要对酶切的反应体系进行处理，直接进行等电点沉淀，简化了生产工艺。相比目前已有的报道，上清液中产物残留率可以降低10倍以上，优势明显。

技术领域

本发明属于重组人胰岛素的制备领域，具体涉及一种胰岛素前体沉淀的回收方法。

背景技术

胰岛素及其类似物是治疗糖尿病最直接和最有效的药物，尤其是对I型和II型晚期糖尿病患者。目前仍然没有替代的药物，开发安全有效、使用方便的胰岛素及新型类似物一直是生物药物开发的一个热点。而随着生物技术的发展，采用重组技术生产的胰岛素已逐渐取代原有的动物提取胰岛素。重组胰岛素的生产过程一般是先通过微生物如大肠杆菌或酵母菌等表达胰岛素原，然后通过胰蛋白酶或赖氨酰内切酶酶切获得去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体(DesB30胰岛素)固体粉末，最后通过对此前体的修饰等反应获得不同的胰岛素衍生物。例如通过对此前体进行转肽反应等工艺可以获得重组人胰岛素；对此前体进行脂肪酸侧链的修饰可以获得长效的地特胰岛素和德谷胰岛素。因此如何提高DesB30胰岛素的收率对于提高重组胰岛素的产率至关重要。

针对酶切过程的优化已经有较多报道。CN105111304A公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，该发明将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清液用阳离子层析柱进行纯化，在层析的洗涤时先后采用两种不同洗涤液进行洗涤，更快速的进行目的蛋白的洗脱，缩短洗脱时间，减少目的蛋白沉淀，同时减少洗脱样品体积，在洗脱时采用pH值7.0～9.0的洗脱液进行洗脱，洗脱后的产物不需进行换相操作，直接加入胰蛋白酶进行酶切转换，酶切转换效率在95％以上，简化了生产工艺，节约了成本，然而由于酶切体系中含有较多的酶以及发酵杂质等，后续一般通过利用等电点沉淀回收的原理从酶切后的反应体系中回收酶切产物DesB30，由于各厂商胰岛素原的纯化方式不一样，导致酶切体系中的物质也千差万别，采用等电点沉淀并不能使DesB30完全沉淀下来，仍会有部分DesB30存在上清液中，导致工艺收率损失较大。

刘海峰(《重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究》，华东理工大学，2014)证实了胰岛素前体单链蛋白上的三个酶切位点在酶切时存在先后顺序，胰蛋白酶首先将胰岛素前体的间隔肽片断迅速去除，生成单链胰岛素前体，随后，单链胰岛素前体在连接肽AAK的后面被进一步酶切，生成双链胰岛素前体，最后，该双链产物再经一次酶切去除连接肽，生成了Des B30胰岛素。这三步的酶切速率差别很大，第一步酶切速率很快，第二步相对较慢，第三步则不能完全反应，即使过夜酶切还有近20％的双链胰岛素前体无法转变为Des B30胰岛素。胰岛素前体形成的聚体空间结构是造成DesB30收率不能进一步提高的原因，论文中在有机溶剂乙腈的存在下进行酶切，酶切后直接采用等电点沉淀，难以将DesB30沉淀出来，其采用先高温旋转蒸发出乙腈再等电点沉淀，仍有6.3％的产物无法回收，而且高温下旋转蒸发会有明显的降解产物出现影响后续的工艺步骤。

综上所述，目前尚缺乏有效的方法来提高DesB30胰岛素的收率。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种胰岛素前体沉淀的回收方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体沉淀的回收方法，包括：