[发明专利]一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法

说明书

本发明公开一种利用造纸废液生物合成丁二酸的方法，通过对宿主菌进行代谢途径改造，利用造纸废液为原料生产丁二酸，所述造纸废液为造纸过程中产生的原始废液或者是对原始废液进行蒸馏处理，分离出糖类，残留的含有乙酸和甲酸的蒸馏残留液。本发明通过代谢工程手段构建重组大肠杆菌菌株，能将废液中的抑制物乙酸高效地转化为丁二酸，且利用其中的甲酸为该代谢过程提供能量，提高乙酸的利用率，有效地解决了造纸废液中乙酸及甲酸利用问题。本发明构建的重组大肠杆菌可以利用造纸废液为原料，高效生物合成丁二酸，为造纸废液的利用提供一种新的处理方法。

技术领域

本发明属于生物工程和环境工程领域，更具体地讲，涉及一种利用造纸废液为原料生物合成丁二酸的方法。

背景技术

造纸过程产生的工业废水具有排放量大、COD高、pH变化幅度大、色度高、有硫醇类恶臭气味等特点，属于较难处理的工业废水，我国造纸工业的平均单位产品耗水量要比发达国家高出1倍以上，年排水量仅次于化学工业及钢铁工业，产生了巨大的废水污染。目前，对造纸废液的处理方法较多，包括物理处理法(过滤法和气浮法)、物理化学法(混凝沉淀法、膜分离法、吸附法)、化学处理法(化学氧化法、光催化氧化法)及生物处理法(真菌处理法、厌氧生物法、好氧生物法)。虽然对造纸废液的处理方法较多，但各种方法都存在着不同的技术问题。生物处理法虽然较其他方法经济成本低且环境友好，但其主要是通过在一定的条件下将有机物降解，存在降解不完全现象。

在造纸废液中含有多种可利用的碳源，如木糖、葡萄糖、阿拉伯糖及未充分水解的木质素等，同时废液中也存在多种抑制物如乙酸、甲酸、糠醛、5-甲基糠醛等，由于这些抑制物的存在也进一步阻碍了糖类的利用。从造纸废液中经过蒸馏处理较容易的分离出糖类物质，但对于抑制物乙酸与甲酸的利用目前没有报道，因此，通过生物转化法将造纸废液中的可利用碳源转化为高附加值化合物，是高效经济处理废液的一种方法。

丁二酸作为一种重要的四碳化合物，广泛地应用于表面活性剂、食品添加剂、医药中间体、可生物降解聚合物的前体等方面。传统的丁二酸多由石油经化工合成生产，但因石油的不可再生和环境污染等原因使得丁二酸作为基本化工原料的广泛应用受到限制。以微生物发酵生产丁二酸则具有较多优点：如环境友好、原料可再生、成本低廉等。现有的丁二酸发酵生产研究大多以糖类为碳源，同时也有报道以非粮食基的甘油和乙酸为碳源。乙酸是许多微生物厌氧代谢的终产物和有氧代谢的不完全氧化产物，同时，木质纤维素在水解利用的过程中也会产生大量的乙酸。野生型大肠杆菌能够利用乙酸为唯一碳源供生长，但细胞内无任何代谢副产物积累，代谢乙酸产生的能量和化合物均用于菌体合成。Li等(ACSSynth Biol.2016；5(11):1299–307)通过对大肠杆菌MG1655进行代谢工程改造，包括敲除琥珀酸脱氢酶编码基因(sdhAB)、乙醛酸循环阻遏基因(iclR)、苹果酸酶编码基因(maeB)及过表达柠檬酸合酶编码基因(gltA)，通过改造的大肠杆菌能在好氧条件下以乙酸为唯一的碳源生产丁二酸。在摇瓶发酵过程中，该基因工程菌在72h能积累16.53mM丁二酸；采用静息细胞转化的方式，该菌株在42h生产丁二酸61.71mM。然而，该基因工程菌丁二酸的产量与产率均较低，且以纯乙酸钠为碳源，存在能量不足而产量产率低等问题。

在野生型大肠杆菌中，甲酸在甲酸脱氢酶的作用下转化为CO₂和H₂，但在来源于Candida boidinii菌株的甲酸脱氢酶作用下，1mole甲酸则转化为1mole CO₂和NADH，且与大肠杆菌自身的甲酸脱氢酶Km值(26mM)相比，来源于C.boidinii菌株的甲酸脱氢酶Km值则更低(13mM)(J.Biol.Chem.1991；(266):13731–13736)。San等(Metab Eng.2002；(4):217–229)在厌氧条件下，通过过表达来源于C.boidinii的甲酸脱氢酶编码基因，在培养基中添加甲酸，以提高胞内可利用的NADH水平。而在好氧条件下，NADH通过氧化呼吸链可以产生ATP，以维持菌体能量代谢。

发明内容