[发明专利]一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法。

背景技术

一、细胞培养的外源因子污染

生物制品是采用生物技术制备而成的具有生物活性的药品、疫苗、抗体、生化产品等的总称，其生产工艺复杂且受多种因素影响，生产过程中使用的各种材料来源复杂，可能污染细菌、真菌、支原体和病毒等外源因子，引起产品安全性问题。其中生物制品生产用细胞是生物制品生产的一个关键要素，目前国内外许多生物制品均是以细胞基质材科为基础生产生物制品。同时，使用细胞基质生产生物制品过程及其复杂，加之周期长、易污染等客观因素，导至外源因子污染成为影响生物制品生物安全性的一个极其重要的因素。因此，对生物制品生产用细胞基质及过程进行严格的质量控制，排除外源因子污染，是生物制品生产的重要环节。

鉴于生物制品的应用对象是人体免疫或疾病治疗。因此，生物制品终产品的质量与生物安全性密切相关，是各国药品管理机构最为关注的问题，各国药典中最严格控制的指标之一。生物制品生产用细胞基质需建立各级细胞库，细胞库质量是产品质量的上游保证，《中华人民共和国药典，三部，2015版》及《生物制品通则》规定各级细胞库及终产品均需要进行外源因子污染检定，检测结果应无外源因子污染。

目前，中国药典规定对于细胞外源因子污染的检测以培养法为主，细菌、真菌、支原体因其生物学持性所至，用多种培养方法联合检测基本能检测出所有的污染物。而对于细胞内、外源病毒污染的检测，目前采用的体外培养观察加红细胞吸附法、动物体内及鸡胚接种法等均为间接的检测方法，不仅检测周期长，操作复杂且易受干扰，同时覆盖的范围窄，对某些特定病毒，且病毒密度比较低的样品检测技术更为复杂多样。因此，急需一种能够快速、直观观察污染的病毒颗粒形态，且又能同时对低密度病毒进行精确定量的方法，解诀细胞内、外源病毒污染的精确定量检测问题。

二、负染色电镜技术与病毒学研究

电子显微镜技术在自然科学各个领域中都发挥了重要的作用，尤其是生物学、材料科学、医药卫生等相关学科，更是不可缺少的工具。负染色电子显微镜技术在病毒学研究中常规使用，尤其对病毒形态观察、病毒分类和病毒诊断领域起非常重要的作用。对于特征性病毒，可直观地立刻做出判定，对于特征不太强的病毒，可结合其它指标综合判定。

负染色电子显微镜定量实验(Quantitation of Viral Contaminants by Negative Stain Electron Microscopy)是一项运用负染色电子显微镜观察待检测样品中是否含有病毒颗粒，同时通过直接计数病毒颗粒，对样品中的病毒浓度进行定量的技术。上世纪70～80年代该技术已被Gelderblomet al(1978)和Hammond et al(1981)用于病毒的定量检测，基本流程是纯化后的病毒与电镜铜网直接超速离心，电子显微镜视野下拍照并直接对病毒颗粒计数。由于当时的实验条件所限，加之电子显微镜技术参数设置差强人意，至使病毒定量误差较大，难于推广应用。近年来，也有少数新技术、新方法问世，但仅限于对高密度(10^6-7)以上的病毒进行定量，对低密度(10^3-5)的病毒定量仍无能为力。而对低密度(10^3-5)的病毒定量，正是细胞培养中内、外源病毒污染定量检测期待的关键技术。

纳米颗粒是一种人工制造的、大小不超过100纳米的微型颗粒。它的形态可以是乳胶体、聚合物、陶瓷颗粒、金属颗粒和碳颗粒。近年来，纳米颗粒越来越多地应用于生物医学、药物载体及生物活性大分子吸附中。直接用于人体的纳米颗粒依其形状、大小、原始材料、表面大小、带电荷以及用量、作用时间等方面所表现出的生物毒性差异显著，需经严格的毒理试验评估后方可使用。而用于离体试验的标准参照物，更多关注纳米颗粒的大小形状，表面结构及带电荷状态，相溶牲等，对纳米颗粒的选择余地会更大。纳米颗粒根据表面基团功能的不同，可分为特异性吸附型和非特异性吸附型，前者为特异性稳定吸附，是一种典型的生物学效应，后者是一种不稳定的吸附聚集现象，产生的是物理吸附作用，结合力不够牢固，随着时间推移，条件的改变，吸附的物体会缓慢脱落，形成分散状态。

发明内容