[发明专利]一种透明质酸的生物发酵生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，尤其是一种透明质酸的生物发酵生产工艺。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)又名玻璃酸，具有高度的保水、润肤及抗菌入侵的保护作用而广泛用作化妆品的添加剂。HA作为一种生化药物，主要用于治疗关节炎、眼科粘性手术、软组织修复以及外科手术后的粘性抑制剂等。HA 是由D-葡糖醛酸和乙酰氨基-D-葡萄糖按1:1的摩尔比组成的酸性粘多糖。在细胞质膜内壁，在HA合成酶作用下，HA由尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖(UDP-GlcNAc) 和尿苷二磷酸-葡糖醛酸(UDP-GlcA)两前提物合成。HA无种属差异性，无论何种来源，其结构和组成都是一样的，仅存在相对分子质量的差别。

当前，HA的生产仍然主要是动物组织提取法和微生物发酵法。动物组织提取法的原料受限、产量低、分离纯化过程复杂(含硫酸软骨素、硫酸葡胺聚糖等多糖杂质)，生产成本高，所获得的HA分子量也较小，不能满足市场需求。而微生物发酵法具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。但是，由于细菌自身代谢与产物表达之间的不平衡，严重制约了透明质酸的产量。于是，改进细菌发酵的工艺条件，以提高透明质酸的产量具有广阔的前景。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种透明质酸的生物发酵生产工艺，该生产工艺通过改进发酵过程营养物质的成分、添加方式以及发酵过程的温度等条件，以寻求发酵过程中微生物自身生长与产物表达之间的平衡，从而提高透明质酸的产量。

本发明采用的技术方案如下：

一种透明质酸的生物发酵生产工艺，其包括：

菌种活化：将菌种接种于斜面菌种培养基上活化得到活化菌种；

种子液制备：将活化菌种接种于种子培养基培养得到种子液；

扩大培养：将种子液接种于扩大培养基中扩大培养得到扩大培养液；

发酵培养：将扩大培养液接种至装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养分为发酵前期和发酵后期；发酵前期持续4-6h，温度为35-37℃，发酵后期持续16-24h，温度为28-32℃；发酵培养过程中，保持pH 7.0-7.5。

由于采用了上述技术方案，一方面将菌液的扩大培养与发酵培养相对独立，另一方面将发酵培养分为发酵前期和发酵后期，发酵前期温度较高，适合于菌体的快速增值，发酵后期温度较低，适合于透明质酸的累积，以此实现菌体自身代谢与产物表达之间的平衡，从而提高透明质酸的产量。

本发明中采用的菌种为兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus) AWA008，由中国专利CN104059865A公开。

本发明较佳的实施例中，发酵培养基的成分及含量分别为:葡萄糖35-40g/L，蔗糖5-10g/L，酵母粉10-12g/L，尿素5-8g/L，蛋白胨5-8g/L，K₂HPO₄ 2.0-2.4g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5-1.0g/L。

由于采用了上述技术方案，发酵过程中采用复合碳源以及复合氮源，能有效提高菌体表达透明质酸的能力。

本发明较佳的实施例中，种子培养基和扩大培养基的成分及含量与发酵培养基一致。

由于采用了上述技术方案，在种子培养和发酵培养阶段，菌种适应了发酵培养基所提供的营养环境，相当于进行了一个驯化过程，当其进入发酵阶段，就能直接利用发酵培养基中的营养进行自身代谢或产物表达。

本发明较佳的实施例中，从进入发酵后期开始，每隔4-6h添加一次发酵培养基，共添加四次；四次添加的发酵培养基的体积之比依次为1：2：4：8，且添加总体积等于原始的发酵培养基的体积。

由于采用了上述技术方案，即采用了类指数的补料方式进行发酵。发酵过程中，随着透明质酸的累积，发酵液的粘度不断增大，从而限制发酵过程。通过补加新鲜的培养基能缓解透明质酸的反馈抑制以及葡萄糖的分解阻遏效应。并且，类指数的补料方式复合菌体自身的生长代谢规律，从而能有效促进菌体的代谢和透明质酸的累积。

本发明较佳的实施例中，所述发酵后期，向发酵液基中加入吐温80溶解于质量分数为2％稀碱中的溶液，至吐温80在发酵培养基中的质量分数为 0.04-0.06％。