[发明专利]一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置

说明书

技术领域

本发明属于光学超分辨显微成像领域，特别涉及一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置。

背景技术

光学显微镜，特别是荧光显微镜，由于其可以研究细胞和生物体的三维内部结构的能力以及通过荧光染料标记可以对分子进行特异性观测的优势，而被广泛应用于生命科学领域的研究中。但是传统光学显微镜的空间分辨率受入射光波长的限制，无法突破衍射极限，只能达到200nm左右。

作为一种功能强大的超分辨显微成像技术，结构光照明显微镜可以突破光学衍射极限，将传统荧光显微镜的横向分辨率提高两倍。它的基本原理是使用结构光图样照明样品，一般是正弦图样，利用频率混叠效应将样品内通常无法被观测到的高频成分移动到成像系统的低频通带范围之内，从而可以获取样品更多的高频细节信息，提高了分辨率。与其他各种成像技术相比，结构光照明显微镜具有很多优点，如相比受激发射损耗显微镜点扫描和单分子定位显微镜需要获取大量图像进行重构，结构光显微镜只需获取很少数量的宽场图像即可恢复出超分辨图像，成像速度高，可用于实时观测和活体成像；相比单分子定位显微镜需要特异荧光染料，结构光显微镜无需特异染料，大大扩展了它的应用范围。

目前在生命科学研究时另外一个迫切需求的技术就是可以对样品进行活体三维成像，这有助于科研工作者们更好的理解生物体各组织的功能和相互之间的联系。由于二维结构光照明显微镜使用双光束进行干涉，其光学传递函数在轴向上会出现中心缺失现象，导致轴向分辨率过低，无法应用于三维成像。如果使用三束相干光进行干涉，其产生的结构光照明图样会包含更多的高频分量，从而消除了光学传递函数的中心缺失现象，保证它在横向和轴向上都能获得两倍于传统光学显微镜的分辨率，可用于三维超分辨成像。

发明内容

本发明提供了一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置，使用两个分束镜产生三束相干光，其中两束光分别通过振镜控制进行扫描，最后通过物镜收集三束光在样品表明进行干涉产生三维结构光图样。本装置成像速度快；实验误差小；入射光能量利用率高；干涉图样对比度高，成像质量高；可以实现三维超分辨，特别适用于对荧光样品进行活体三维成像。

为实现上述发明目的，本发明所采用的具体技术方案如下：

一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置，包括激发光路模块，用于将入射激光分为三路，在样品内部进行干涉产生三维结构光照明图样；和成像光路模块，用于收集待测样品发出的荧光信号，利用计算机进行数据处理和图像重构；

所述的激发光路模块包括依次布置的：

激光器，发出激光光束；

分束组件，包括依次布置两个分束镜，用于产生三路入射光；

振镜系统，用于控制光束扫描方向，实现结构光图样的旋转；

显微物镜，用于将三束切向线偏振光聚焦到样品上进行干涉产生结构光照明图样，并收集样品发出的荧光强度信号；

所述的成像光路模块包括依次布置的：

二向色镜，用于透射入射光、反射样品发出的荧光；

工业相机，用于收集所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制振镜系统扫描和压电陶瓷移动以改变结构光图样的方向和相位，控制半波片旋转保证正入射光偏振方向始终保持切向，控制样品台进行轴向扫描获取三维信息，控制工业相机获取样品发出的荧光信号，并对相机采集的荧光强度信号进行数据处理和相位重构，得到二维和三维超分辨图像。

优选的，所述激光器与两个分束镜之间依次放置有：单模光纤，用于对激光光束进行滤波；起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；和半波片，用于控制入射到分束镜上的线偏振光方向。

可选的，所述两套振镜系统采用透射式或反射式振镜系统均可。

优选的，所述两套振镜系统的透镜焦面位置处各放置有切向光偏振片转换器，用于旋转两路线偏振光的偏振方向，保证在样品上发生干涉的入射光均为切向线偏振光，以产生对比度最大的结构光照明图样。

优选的，所述两套振镜系统与显微物镜之间依次放置有：平面反射镜，用于改变振镜出来的光束的传播方向，使其斜入射到后方扫描透镜上；和扫描透镜，用于使三路入射光均聚焦到显微物镜后瞳面处。

设置在一路光路上的平面反射镜由压电陶瓷驱动进行移动，改变光程差使结构光照明图样产生相移。