[发明专利]一种用于检测目的基因低频突变的引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于检测目的基因低频突变的引物及试剂盒。

背景技术

肿瘤具有高度异质性，其中的致病突变可能以极低的比例存在，肿瘤患者的血液、尿液和脑脊液中的cfDNA中的目的基因的突变位点或突变区域的突变频率会影响将来肿瘤用药或者肿瘤发展方向的判断。因此，检测肿瘤患者的血液、尿液和脑脊液中的cfDNA中的目的基因的突变位点或突变区域的突变频率成为研究重点，这就需要对突变位点或者突变区域进行测序，检测突变频率。

目前二代测序最准的Hiseq测序本身的错误率就在0.2％上下，除此之外，当前的DNA聚合酶的扩增错误率也在10^-7-10^-5之间，因此，如何能够在测序结果中排除扩增错误和测序错误，直接反应出样本中原始模板分子的低频变异情况就成为了问题的关键。

肿瘤患者的血液、尿液和脑脊液中的cfDNA的含量很少，这对低频突变的检测来说是个难题。当前市场上主要有三种低频突变的检测方式：数字PCR、下一代测序(next-generation sequencing，NGS)和突变扩增系统(amplification refractory mutation system，ARMS)PCR。NGS具有高通量、低成本、快速、操作简便等优势，是目前国内最热门的低频突变检测技术。在NGS过程中，构建基因文库是整个测序进程中第一个步骤，也是最为关键步骤，基因文库的质量直接影响后续的测序工作。但是，市场上常规的建库方法均存在成本高、检测周期长、流程复杂、文库易被污染以及对检测人员要求高等缺陷，不适用于大量样本的测序建库。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于检测待测样本目的基因待检区域的突变情况的成套引物。

本发明提供的成套引物包括Barcode引物F1、上游引物F2、下游外引物R1、下游内引物R2；

所述Barcode引物F1依次由测序接头1、用于区分不同样本的barcode序列和通用序列1组成；

所述上游引物F2依次由通用序列1、分子标签、特定碱基序列和上游特异性引物序列组成；

所述下游外引物R1依次由测序接头2和通用序列2组成；

所述下游内引物R2依次由通用序列2和下游特异性引物序列组成；

所述测序接头1和所述测序接头2为根据不同测序平台选择对应的测序接头；

所述barcode序列均为长度为8-12nt、无连续碱基，且GC含量为40-60％的核苷酸；

所述通用序列1和所述通用序列2的长度均为16-25nt，且无连续碱基，GC含量为35-65％，无明显二级结构；

所述特定碱基序列为GAT；

所述上游特异性引物序列和所述下游特异性引物序列是扩增所述目的基因待检区域的引物；

所述分子标签为10-12位随机碱基。

上述成套引物中，

所述测序平台为Illumina平台，所述测序接头1为I5，所述测序接头2为I7；

或所述测序平台为Ion Torrent平台，所述测序接头1为A，所述测序接头2为P。

上述成套引物中，

所述Barcode引物F1、所述上游引物F2、所述下游外引物R1和所述下游内引物R2的摩尔比为6:(10-6):(1-3):(1-3)。

上述成套引物中，

所述突变为低频突变，具体为突变频率最低至0.1％。

上述成套引物中，

所述待测样本为肿瘤患者的离体血液分离的cfDNA、肿瘤患者的离体尿液分离的cfDNA、肿瘤患者的离体脑脊液分离的cfDNA或肿瘤患者的离体肿瘤组织提取的基因组DNA。

上述成套引物中，

所述通用序列1的核苷酸序列为序列1；

所述通用序列2的核苷酸序列为序列2；

所述测序接头1的核苷酸序列为序列3；

所述测序接头2的核苷酸序列为序列4；

所述用于区分不同样本的barcode序列分别为序列5-序列14；

所述待测基因为NRAS，对应的上游特异性引物序列和下游特异性引物序列分别为序列15和序列16或序列17或序列18；

所述待测基因为ALK，对应的上游特异性引物序列和下游特异性引物序列分别为序列19和序列20或序列21和序列22或序列23和序列24或序列25和序列26或序列27和序列28或序列29和序列30或序列31和序列32；