[发明专利]针对淀粉酶BLA的启动子文库及强启动子

权利要求书

1.一种针对淀粉酶BLA的启动子文库，其特征在于，所述的启动子文库包括SEQ IDNO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQID NO.49所示核苷酸序列的启动子，所述的SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的启动子具有依次增强枯草芽孢杆菌启动淀粉酶BLA基因表达的强度。

2.权利要求1 所述的启动子文库在提供不同强度类型启动子中的应用，所述的启动子可操作性地与目的基因连接，能不同程度的促进枯草芽孢杆菌高表达淀粉酶BLA基因。

3.一种针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1）选择6个已表征的枯草杆菌启动子序列作为出发启动子，以其-35区的保守序列ttg和-10区的保守序列为节点，将启动子分为三个区域，每个区域设计一对互补的寡核苷酸序列，退火后得到对应的DNA双链片段，将退火后的片段混合后，不同启动子的三个区域可通过-35区和-10区随机连接，得到组合启动子片段；

2）将步骤1）得到的启动子片段与淀粉酶BLA探针载体酶连，得到针对BLA的组合启动子载体；

3）建立枯草芽孢杆菌CRISPR/cas9系统，构建cas9蛋白表达载体和靶向整合位点AmyE的sgRNA载体，所述的sgRNA载体上连接有靶向AmyE的靶向核苷酸序列，所述的靶向AmyE的核苷酸序列为GCAGTTACGGCAGTCAATTT；

4）将步骤3）得到的cas9蛋白表达载体转化枯草芽孢杆菌，转化子制备感受态，同时添加IPTG诱导cas9蛋白的表达，使cas9蛋白在整合位点AmyE引入DNA双链断裂，然后将步骤2）得到的组合启动子载体和步骤3）得到的sgRNA载体同时转化该感受态，涂布于含有抗生素选择的平板，得到特定针对淀粉酶BLA的启动子文库；

步骤1）中，所述的出发启动子是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的启动子；所述的寡核苷酸序列为SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其特征在于，步骤2）中所述的淀粉酶BLA探针载体为整合型载体pDGT-BLA，或其他避免游离性质粒拷贝数对文库表征影响的整合型载体。

5.根据权利要求3所述针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其特征在于，步骤3）所述的cas9蛋白表达载体是将cas9蛋白连接到pHT01载体上而得；所述的sgRNA载体是合成p242-BsmBI/BsmBI-sgRNA片段，并连接到pHY300PLK载体上而得。