[发明专利]人源化基因改造动物模型的制备方法及应用

权利要求书

1.一种用于制备BTLA基因人源化的靶向载体，其包含：a）与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自BTLA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b）期望的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c）与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自BTLA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；其中，所述待改变的转换区位于BTLA基因第2外显子，所述期望的供体DNA序列如SEQ ID NO：35所示。

2.根据权利要求1所述的用于制备BTLA基因人源化的靶向载体，其特征在于，所述与待改变的转换区5’端同源的DNA片段的序列如NCBI登录号为NC_000082.6的第45237539-45239051位核苷酸所示；所述与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段的序列如NCBI登录号为NC_000082.6的第45239358-45240854位核苷酸所示。

3.一种用于构建人源化非人动物的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人动物Btla基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Btla基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，所述sgRNA在小鼠Btla基因的靶位点位于小鼠Btla基因的第2外显子上，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ IDNO：1-8任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：9-14任一项所示。

4.根据权利要求3所述的用于构建人源化非人动物的sgRNA序列，其特征在于，所述非人动物为啮齿动物。

5.根据权利要求4所述的用于构建人源化非人动物的sgRNA序列，其特征在于，所述啮齿动物为小鼠。

6.一种包含权利要求3-5任一所述的sgRNA序列的构建体。

7.一种制备包含权利要求3-5任一所述sgRNA序列的sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Btla基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Btla基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；

（2）合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

（3）将步骤（1）获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤（2）所述的pT7-sgRNA载体的双链；

（4）将步骤（3）中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

（1）将序列如SEQ ID NO：1-8所示的任一项sgRNA靶序列和SEQ ID NO：9-14所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

（2）合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：23所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

（3）分别合成步骤（1）中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤（2）所述的pT7-sgRNA载体的双链；

（4）将步骤（3）中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。