[发明专利]一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于疫苗技术领域。更具体地，涉及一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法。

背景技术

目前，制约家禽养殖业快速发展的关键疫病因素依然是禽流感疫情的预防与控制。禽流感（Avian influenza, AI）是禽类感染A型流感病毒引起的疾病综合征(甘孟侯等，1995；高福等，1999)，为区分不同亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）对禽类致病性和毒力，可将禽流感分为低致病性禽流感（Low Pathogenic Avian influenza，LPAI）和高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian influenza，HPAI）。它的暴发给养禽业造成了巨大的经济损失。

与此同时对人类的健康产生重大的影响。近年来，禽流感疫情在世界范围内表现出 高频多发的特点。目前，H7N9亚型流感疫情暴发呈现出季节性。过去几年内新发现的感染 病例均有活禽暴露史(Lam et al.,2015；Tanner et al.,2015；Xie et al.,2015)。虽然之前在家禽中有 分离到H7N9亚型禽流感病毒，但并没有出现感染人的情况。目前在中国暴发的H7N9亚型 流感病毒不但会感染家禽而且还会感染人。近两年，H7N9亚型流感病毒感染人的数量比 H5N1亚型禽流感病毒感染人的数量多，且H7N9亚型禽流感病毒貌似更容易感染不同年龄 段的人群。基因分析结果表明该病毒对哺乳动物具有更大的威胁(Tanner et al.,2015)。2016年 新发现的H7N9亚型禽流感也再次警示着新流感疫情的暴发，2017年H7N9禽流感疫情可能 为近四年最为严重的一年。因此，必须高度重视禽流感，禽流感的的防治及疫苗的研究已成 为当务之急。

虽然疫苗控制禽流感仍存在社会争议，但疫苗结合其他防控措施在控制扩散和清除禽流感疫情方面有着良好的临床表现，疫苗接种仍是防控禽流感的保守措施之一。禽流感疫苗临床应用表现良好，但仍存在负面影响和潜在威胁。为解决这些问题，新型的禽流感疫苗的应用有待继续深入探索和研发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有禽流感疫苗的缺陷和不足，提供一种由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体组成的H7亚型禽流感DNA疫苗，该疫苗能够预防家禽H7亚型禽流感，减少感染，对养殖业与人类健康具有十分重要的意义。

本发明的目的是提供一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种H7亚型禽流感DNA疫苗的制备方法，由禽流感病毒HA基因和真核表达载体连接构建的质粒表达获得。

具体地，所述禽流感病毒HA基因为H7亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/J133/2013(H7N9)的HA基因，序列如SEQ ID NO.3所示。

具体地，所述H7亚型禽流感病毒的HA基因序列经过密码子优化，优化的optiHA基因序列如SEQ ID NO.4所示。

具体地，所述真核表达载体为限制性内切酶SacI、XhoI同时酶切质粒pCAGGK（卡纳抗性）得到的载体片段。所述真核表达载体质粒pCAGGK（质粒基因图谱见图4）是在载体pCAGGS基础上改造而来，具体是由本课题组（华南农业大学禽病研究室）构建并保存。

更具体优选地，所述H7亚型禽流感DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1.获取野生H7亚型禽流感病毒的HA基因，其序列如SEQ ID NO.3所示（序列如图2和图3中Original所示）；

S2.将H7亚型禽流感病毒的HA基因根据鸡的密码子偏嗜性进行优化，优化的optiHA基因序列如SEQ ID NO.4所示（序列如图2和图3中Optimized所示）；

S3.用内切酶SacI和XhoI分别酶切处理optiHA基因与真核表达载体；

S4.回收酶切后的目的片段与载体片段，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取质粒并进行酶切鉴定；

S5.步骤S4获得的阳性质粒表达获得H7亚型禽流感DNA疫苗。

其中，优选地，步骤S3所述酶切的反应体系为：5μL 10×buffer、5μL阳性质粒、2μL 内切酶SacI、2μL 内切酶XhoI、ddH₂O 36μL补足50μL。