[发明专利]一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法

权利要求书

1.一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别制备灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒、新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒、番鸭源细小病毒、小鹅瘟病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒病、Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液，六者等体积混合，得到混合抗原溶液；

2)取由美国埃索公司出品的、型号为MARCOL52的白油，熬制，在熬制的过程中向其中加入所述白油质量4份的司班和所述白油质量2份的硬脂酸铝，得到疫苗佐剂；

3)将步骤1)所得的混合抗原溶液与步骤2)所得的疫苗佐剂以(1～1.5):(1～2)(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；

4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，产蛋前1个月免疫1次，两周后二免，二免两周后三免疫，收集三免后蛋鸡的鸡蛋，即为高免蛋；

5)取步骤4)所得高免蛋，分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆；

6)向步骤5)所得卵黄匀浆中加入其2倍体积的醋酸缓冲液，调pH至4.6～4.8；在15～20℃、搅拌条件下逐滴加入辛酸，至其中正辛酸终浓度为1％(v/v)，4～8℃条件下静置6～8h，然后以4000～6000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经中空纤维柱过滤浓缩后，加入浓缩产物1/10体积的、浓度为0.01mol/l无菌PBS缓冲液，调pH至7.2；向其中加入浓度为1％(v/v)的柳硫汞溶液，至其中柳硫汞终浓度为0.01％(v/v)，搅拌均匀；

7)以30mg/mL的用量向步骤6)所得产物中加入β-葡聚糖干粉，加入冻干保护剂，分装冻干，即得到所述用于水禽的多联卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤1)中灭活的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒毒液、灭活的新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的新型番鸭源鸭呼肠孤病毒和新型肉鸭源鸭呼肠孤病毒，解冻稀释后接种9～10日龄SPF肉鸭胚制备的DEF细胞，培养36～72小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤1)中灭活的番鸭源细小病毒毒液、灭活的小鹅瘟病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的番鸭源细小病毒和小鹅瘟病毒，解冻稀释后接种9～10日龄SPF番鸭胚制备的DEF细胞，培养36～72小时，收获病变的DEF细胞，反复冻融、离心、中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤1)中灭活的Ⅰ型鸭肝炎病毒毒液、灭活的Ⅲ型鸭肝炎病毒毒液是通过以下方法制备的：用冷冻保存的Ⅰ型鸭肝炎病毒病和Ⅲ型鸭肝炎病毒，解冻稀释后接种9～10日龄SPF鸭胚制备的DEF细胞，培养36～72小时，收获病变DEF细胞，反复冻融、离心、中空纤维超滤浓缩、灭活，然后置低温下冰箱保存备用。

5.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于所述醋酸缓冲液是pH为5.0～5.2的、醋酸浓度为0.06mol/L的水溶液。

6.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤6)中第二次对pH的调整是利用饱和碳酸氢钠溶液实现的。

7.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤5)具体包括以下操作：取步骤4)所得高免蛋，用清水洗净外表，再擦净、晾干，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆。

8.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤6)所述中空纤维柱的截留分子量为20KD。