[发明专利]一种新型可调控的双嵌合抗原受体T细胞及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种可调控的双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的双嵌合抗原受体由针对MSLN的第一嵌合抗原受体和针对FITC的第二嵌合抗原受体组成。

2.根据权利要求1所述的一种可调控的双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第一嵌合抗原受体包括MSLN单克隆抗体的轻链和重链可变区MSLNscFv和信号传导结构域，所述的MSLNscFv序列为SEQ ID NO.6或与其具有80％序列同一性的变体，所述的信号传导结构域由铰链区、跨膜区和胞内信号域串联构成。

3.根据权利要求2所述的一种可调控的双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的MSLN单克隆抗体的轻链和重链可变区MSLNscFv在轻链和重链之间设置一个linker，该linker可以是不同的氨基酸序列，优选为Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly GlyGly Ser连接肽。

4.根据权利要求2所述的一种可调控的双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第一嵌合抗原受体的铰链区为IgG1的CH2-CH3序列或人CD8α铰链区，跨膜区为人CD3跨膜区或人CD8跨膜区或人CD28跨膜区，胞内区信号域为人4/1BB共刺激信号域。

5.根据权利要求1或2所述的一种可调控的双嵌合抗原受体，其特征在于：所述第二嵌合抗原受体包括抗FITC单克隆抗体的轻链和重链可变区FITCscFv和信号传导结构域，所述的FITCscFv序列为SEQ ID NO.11或其具有80％序列同一性的变体，所述的信号传导结构域由铰链区、跨膜区和胞内区信号域串联构成。

6.根据权利要求5所述的一种可调控的双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第二嵌合抗原受体的铰链区为IgG1的CH2-CH3序列或人CD8α铰链区，跨膜区为人CD3跨膜区或人CD8跨膜区或人CD28跨膜区，胞内区信号域为抗原识别信号结构CD3ζ。

7.根据权利要求2或6所述的一种可调控的双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的第一嵌合抗原受体的氨基末端和所述的第二嵌合抗原受体的氨基末端各含有一个分泌信号肽。

8.根据权利要求7所述的一种可调控的双嵌合抗原受体，其特征在于：所述的双嵌合抗原受体的下游含有一段蓝色荧光蛋白标签，所述的双嵌合抗原受体与荧光蛋白标签之间含有一段连接肽P2A。

9.根据权利要求8所述的一种可调控的双嵌合抗原受体，其特征在于：双嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在双嵌合抗原受体基因序列的上游含有SEQ ID NO.2所示的Kozak序列，所述的第一嵌合抗原受体与第二嵌合抗原受体之间含有连接序列IRES，序列如SEQ ID NO.3所示。

10.一种转染制备能够表达权利要求1或8所述的双嵌合抗原受体的sdCAR-T细胞的方法，其特征在于：将所述的双嵌合抗原受体基因连接到过表达载体中，采用位点特异性整合酶系统将表达双嵌合抗原受体的基因插入到T淋巴细胞的基因组中，以制备sdCAR-T细胞。

11.一种CAR-T细胞，其特征在于：所述的CAR-T细胞能够表达权利要求1-9中任意一项所述的双嵌合抗原受体。

12.一种控制权利要求10中所制备得到的sdCAR-T细胞的方法，其特征在于：采用包含FITC片段的分子开关与内源肿瘤抗原MSLN联合控制sdCAR-T细胞的活性。

13.根据权利要求12所述的一种控制sdCAR-T细胞的方法，其特征在于：所述的包含FITC片段的分子开关为FITC或FITC偶联多肽、蛋白或小分子化合物得到的片段。