[发明专利]一种耐糖耐酸的β-葡萄糖苷酶及其生产方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐糖耐酸的β‑葡萄糖苷酶及其生产。所述β‑葡萄糖苷酶产自黑曲霉(Aspergillus niger)AN‑4，保藏编号CGMCCNo.14139。黑曲霉AN‑4所产耐高糖浓度的β‑葡萄糖苷酶平均摇瓶发酵活力在523U/mL以上；该β‑葡萄糖苷酶最适反应pH范围为4.4‑5.4，在pH3.5‑7.5范围内较稳定；热稳定性良好，最适反应温度范围45‑65℃，在75℃保温1h仍具有75％活力；且具有较好的葡萄糖耐受性。在纤维素降解、风味剂等应用中效果良好，可广泛用于食品、医药、化工等行业。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐糖耐酸β-葡萄糖苷酶及其生产方法。

背景技术：

β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。β-葡萄糖苷酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，一般认为纤维素类物质经酶促作用成葡萄糖至少需要3种酶：内切1,4-葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶把纤维素降解成纤维二糖，它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。在这个过程中β-葡萄糖苷酶起作关键作用，而在纤维素酶组分中β-葡萄糖苷酶含量少、活力低，成为纤维素酶解的瓶颈。此外，黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶对葡萄糖的耐受系数低，因而随着体系中葡萄糖浓度的升高，其降解纤维二糖的活力将受到极大的抑制，从而影响纤维素的连续酶解速率及效果。

β-葡萄糖苷酶在食物中可以与阿拉伯糖苷酶等风味酶协同作用于风味前体物—β-糖苷，促进挥发性糖苷配基的释放，起到增香作用。目前β-葡萄糖苷酶作为风味剂广泛应用于茶叶、果汁和果酒中增香，β-葡萄糖苷酶还经常作为青梅、柑橘、橄榄中的去苦剂，除去苦味。β-葡萄糖苷酶应用于生产低聚龙胆糖，低聚龙胆糖比麦芽糖浆具有更高的吸水性和较低的粘度，可预防食品中的淀粉老化和保持食品中的水分，具有增味作用和显著的保健功能。β-葡萄糖苷酶还能使大豆异黄酮苷等生物苷类物质脱去糖基，变成分子量较小的高生物活性苷元，进而提高生物利用率。β-葡萄糖苷酶与纤维素内切酶、纤维素外切酶基因转入酵母菌中进行同步糖化发酵制造生物酒精，可以使还原出来的糖被酵母利用生成乙醇，解除了产物对酶的抑制作用。β-葡萄糖苷酶的酶活高低是以茜草科植物栀子为原料生产天然色素栀子蓝的技术关键。植物中β-葡萄糖苷酶能分解植物中丰富的葡萄糖苷，释放有毒的苷配基部分，是植物体中防御食植动物和害虫的主要化学物质。医学中β-葡萄糖苷酶的应用在某些癌症的诊断、治疗中也发挥着重要作用，并获得了许多成功。日用化工业中，利用β-葡萄糖苷酶的转糖苷作用，可以生产非离子表面活性剂烷基糖苷。另外，根据β-葡萄糖苷酶的半乳糖酶活力还可将其应用于乳品工业来分解乳糖，与其它酶协同作用生产葡萄糖与单细胞蛋白。

目前，在国外β-葡萄糖苷酶已经有大规模工业化生产，发酵酶活力一般在1000U/mL左右，几乎垄断了整个市场。黑曲霉所产高活性的β-葡萄糖苷酶因其安全性在食品、医药等领域中有很好的发展前景。β-葡萄糖苷酶应用广泛，但由于国内一直未形成产业化，价格高昂，限制了大规模应用，因此低成本高耐受性的β-葡萄糖苷酶一旦上市，将会有巨大的市场潜力。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一种耐糖耐酸β-葡萄糖苷酶，该β-葡萄糖苷酶产自黑曲霉。

所述黑曲霉具体为黑曲霉(Aspergillus niger)AN-4，该菌株已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.14139。

所述黑曲霉AN-4是通过Co⁶⁰辐射诱变的方式获得的高产β-葡萄糖苷酶的菌株，液体摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶活力达到523U/mL。

所述黑曲霉AN-4液体摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的方法具体如下：