[发明专利]一种细胞外囊泡中RNA的提取方法

说明书

本发明涉及一种细胞外囊泡中RNA的提取方法，该提取方法包括以下步骤：S1：分离纯化生物样品中的细胞外囊泡，裂解该分离纯化的细胞外囊泡；S2：加入有机溶剂使RNA进入水相；S3：将醇类有机溶剂加入到步骤S2得到的含有RNA的水相中；S4：加入含有阳离子的试剂，则该阳离子的试剂与带负电的RNA结合；S5：加入含有惰性共沉淀试剂成分的溶液；S6：离心步骤S5中得到的溶液，得到RNA沉淀；S7：洗涤沉淀，再重新溶解沉淀即为细胞外囊泡RNA溶液。本发明的RNA提取方法具有提取时间短、成本低、得率高、纯度高、效果好、方便后续试验等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡中RNA的提取方法。

背景技术

细胞外囊泡指细胞释放到外界环境中的具有磷脂双分子层结构包裹的一切具膜囊泡结构。常见的细胞外囊泡包括外泌体、微囊泡、凋亡小体、菌体外膜泡等种类。

目前常规细胞外囊泡RNA抽提方法的原理是以苯酚为主要提取试剂辅以异硫氰酸胍或β-巯基乙醇，利用苯酚解聚蛋白质和核酸，同时变性蛋白质，由于苯酚不足以抑制RNA酶的活性，因此需要利用异硫氰酸胍或β-巯基乙醇变性RNA酶。之后加入氯仿等试剂萃取样品中的RNA再离心得到含有RNA的上层水相或不加氯仿而直接使用吸附材料吸附系统中的RNA。利用异丙醇等会替换RNA表面的结合水，包绕RNA使其疏水聚沉，离心即可沉淀RNA。通过70％～75％的乙醇等醇的水溶液洗涤RNA沉淀，最终得到RNA。如附图1所示，以目前最为常见的商品化RNA抽提试剂trizol为例，示意RNA抽提过程。步骤1中通过含有苯酚和异硫氰酸胍的trizol裂解样品，使样品中的RNA游离释放到体系中；步骤2中通过加入氯仿并充分震荡，使氯仿萃取RNA，通过高速离心得到步骤3中富含RNA的上层水相以及含有蛋白和核酸的中层、下层有机相；步骤4将上层水相转移至新管中，加入异丙醇等醇类试剂，改变RNA在系统中的溶解性，再利用离心沉淀RNA；由于RNA不溶于醇，所以利用70％～75％的乙醇水溶液洗涤RNA，去除RNA沉淀中的杂质；离心弃上清，再用已经去除RNA酶的水溶解RNA即可。

然而，由于细胞外囊泡样品不容易获得，一般量都非常少，则使用上述传统的细胞外囊泡RNA抽提方法存在以下几个缺点：1、步骤4中异丙醇通过夺取RNA周围的结合水，促进RNA聚沉，由于细胞外囊泡样品中RNA含量较少，而RNA又微溶于水，所以仅用异丙醇不足以沉淀体系中的RNA，这一步操作会带来很大比例的RNA损失，甚至造成RNA抽提失败。2、步骤6中由于微量的RNA沉淀没有其他物质的保护，又由于RNA微溶于水，因此在洗涤过程中微量的RNA直接溶于水，造成RNA抽提失败。3、步骤6和步骤7中通过离心使RNA沉淀，但由于细胞外囊泡样品通常很少，抽提得到的RNA量也很少，通常无法看到沉淀，在弃上清过程中容易将微量的RNA沉淀吸走丢弃而造成RNA抽提失败。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种细胞外囊泡中RNA的提取方法，以解决了现有技术中的不足。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种细胞外囊泡中RNA的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

S1：分离纯化生物样品中的细胞外囊泡，裂解该分离纯化的细胞外囊泡；

S2：加入有机溶剂使步骤S1中的RNA进入水相；

S3：将醇类有机溶剂加入到步骤S2得到的含有RNA的水相中，混匀；

S4：步骤S3中的溶液混匀后，立刻加入含有阳离子的试剂，轻轻混匀，则该阳离子的试剂与带负电的RNA结合；

S5：加入惰性共沉淀溶液到步骤S4中得到的溶液中；

S6：离心步骤S5中得到的溶液，得到RNA沉淀；

S7：洗涤步骤S6中得到的沉淀，再重新溶解沉淀即为细胞外囊泡RNA溶液。