[发明专利]杂交瘤细胞冻存保种的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体的制备，尤其是涉及一种复苏后细胞成活率较高的杂交瘤细胞冻存保种的新方法。

背景技术

1975年Kohler和Milstein建立了杂交瘤技术，将小鼠骨髓瘤细胞与产生绵羊红细胞的小鼠脾细胞融合，形成的杂交瘤细胞既能产生抗体又能进行分裂繁殖，且产生的抗体只能识别一种抗原决定簇，称为单克隆抗体。目前单抗主要应用于疾病的预防、诊断和治疗，生物物质的纯化及蛋白结构功能的研究中。治疗性单抗的市场在新药开发中有逐年增长的趋势，1997年单抗的销售额是50亿美金，此后每年都有40%到50%的增长，至2003年已达到1997年的10倍，达500亿美金，由此可见单抗技术是生物技术领域中升起的一颗新星。

单克隆抗体是未来治疗学上的一大研究热点，有报道称单克隆抗体药物将成为生物医药研究的主旋律。迄今为止世界上已经研制出了数以千计的单克隆抗体，并广泛应用于生物学、医学领域，在疾病的诊断和治疗方面发挥着重要作用。随着对单克隆抗体药物研究的不断深入以及新药的不断推出，单克隆抗体药物一直处于较高的增长率；同时单克隆抗体不仅在体外诊断试剂上得以广泛应用，还可直接用于对人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔的前景。

2010年全球治疗用单抗药物的销售总额达到440亿美元，如果加上100亿美元的单抗诊断和研究试剂，单抗药物的市场总量达到550亿美元。2011年单抗药物的市场总量已经达到628亿美元。未来，全球单克隆抗体药依旧会保持较高的增长率。到2015年，全球单克隆抗体药销售额有望达980亿美元左右。我国的单克隆抗体药物从无到有，每年以50%以上的速度递增，在我国医药市场发挥越来越重要的作用。

2011年，单克隆抗体药物继续领跑全球药品市场。2000-2010年10年间，全球单克隆抗体药物市场的复合增长率高达32%。2011年，全球处方药前20位中，有6个为单克隆抗体药物，其中有5个销售额超过50亿美元。而在此前的2009年和2008年，该数字分别为400亿美元和370亿美元。当前，几乎所有大型制药公司都有单抗研发项目。在2011年全球最畅销的20种药品中。2011年，全球生物制药产品的市场规模超过1550亿美元，占制药/生物制药产品的25%。不过，有研究数据表明，生物制药产品今后几年在全球市场上的占比将明显上升。

目前国内外实验室广泛采用的大量制备单抗的方法主要有两大系统，一是体外培养法；二是动物体内生产法。

杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞（anchorage dependent cell，ADC），因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含20%小牛血清的培养基培养，杂交瘤细胞浓度以1×10⁶-2×10⁶/ml为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约10-50ug/ml。显然，这种方法制备的单抗量极为有限，无疑是不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养，单位体积内细胞数量越多，杂交瘤细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。

目前在杂交瘤细胞的大量培养中采用的悬浮培养法：小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器（美国、加拿大、法国和德国等几家公司生产），其培养方式可分为纯批式、流加式、半连续式和连续式。

目前在杂交瘤细胞的大量培养中采用的微载体培养法：微载体（Microcarrier）是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，在搅拌作用下微载体 悬浮于培养液中，细胞则在固体颗粒表面生长成单层。可用作细胞大量培养的微载体主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品，其中以Cytodex I，Biosilon和Superbeads为好。微载体培养的基本方法与悬浮培养相同。近来的研究表明，该法是杂交瘤细胞大量培养的理想途径之一。