[发明专利]一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法

权利要求书

1.一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；

S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白和重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60-70％汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；

S3.以神经上皮预诱导细胞经OPCs培养基培养得到P0代OPCs，并传代培养至P2代；

S4.以P2代OPCs制备OPCs滋养层；

S5.制备DRG感觉神经元细胞，以OPCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养；

所述MSCs培养基为含2％血清替代物的无血清培养基；

所述神经分化培养基为包含以下成分的DMEM/F12：

1×B27，

1×N2，

1uM 1，25-二羟维生素D3，

40ng/mL三碘甲状腺氨酸，

0.5ug/mL人褪黑素，

20ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，

20ng/mL重组人表皮生长因子；

所述OPCs培养基为包含以下成分的DMEM/F12：

1×B27，

1×N2，

2mM L-谷氨酰胺，

1uM 1，25-二羟维生素D3，

40ng/mL三碘甲状腺氨酸，

0.5ug/mL人褪黑素，

20ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，

20ng/mL重组人表皮生长因子，

20ng/mL重组人血小板来源生长因子AA，

4ng/mL重组人神经营养因子3。

2.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括如下步骤：足月健康新生儿脐带经洗涤，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎，以MSCs培养基悬浮后，转移至培养瓶置于CO₂培养箱内培养，培养至第14天时，加入消化液室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀物以尼龙细胞筛过滤，收集滤液，离心弃上清，收获沉淀物，记为P0代脐带MSCs；以MSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度，接种至新的组织培养瓶中培养至第4天，收获，记为P1代脐带MSCs，将P1代继续培养至P2代。

3.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括如下步骤：以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，培养至60-70％汇合，换神经分化培养基，37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养4天，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，即为神经上皮预诱导细胞。

4.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以OPCs培养基重悬神经上皮预诱导细胞，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，隔天换液，60-80％汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面，加入Accutase^TM消化液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代OPCs，P0代OPCs传代培养至P2代时收获。

5.根据权利要求4所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述P0代OPCs传代培养的培养体系为：经OPCs培养基悬浮，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的组织培养瓶。

6.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S4进一步包括如下步骤：以OPCs培养基重悬P2代OPCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，培养至24小时，换含3％FBS的DMEM/F12培养48小时备用，此为OPCs滋养层。

7.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤5进一步包括如下步骤：断颈处死成年雄性Wistar大鼠，手术取DRG，以含0.1mg/mLNB4的DMEM/F12消化DRG，600g离心10分钟，弃上清；以胰蛋白酶溶液重悬沉淀，37℃消化15分钟后终止，离心弃上清；沉淀以生理盐水洗涤，以移液管抽吸吹打，离心弃上清，沉淀为DRG感觉神经元细胞；以含3％FBS的DMEM/F12重悬DRG感觉神经元细胞，调整细胞密度；吸弃OPCs滋养层培养基，再接种DRG感觉神经元细胞悬液，37℃，5％CO₂条件下共培养48小时。