[发明专利]一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备及其应用

权利要求书

1.一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，其特征在于：将CD8leader、人源化抗TNFR2的单链抗体、CD8的铰链区和跨膜区、CD3ζ胞内信号区依次串联构成，得到融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ，将所述融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ插入慢病毒表达载体，包装成携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到靶向免疫检测点TNFR2的CIK；所述融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，其特征在于，所述患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下制取：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞；用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素2、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时 ；每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率；CD3+阳性率> 80％，CD3+CD56+双阳性率> 20％，视为CIK诱导成功，收获患者自体淋巴细胞诱导的CIK，并留取该CIK待病毒感染。

3.如权利要求1所述的一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，其特征在于，包装成携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒如下操作：将慢病毒包装细胞系293T接种于含培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染；重组质粒与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，具体方法参考分子克隆；转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落；48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达；72h后，收集上清，过滤除菌，测定病毒滴度，在-80℃低温冰箱中保存。

4.一种识别后进行治疗恶性肿瘤的药物，其特征在于：含有权利要求1所述的靶向免疫检测点TNFR2的CIK。

5.权利要求1所述的靶向免疫检测点TNFR2的CIK用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。

6.如权利要求5所述的制备治疗恶性肿瘤的药物的用途，其特征在于：所述恶性肿瘤为肾癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和卵巢癌。