[发明专利]产D-苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了产D‑苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明所提供的包括如下步骤：将与D‑苯乳酸合成相关的基因导入宿主菌得到产D‑苯乳酸的重组菌；所述与D‑苯乳酸合成相关的基因为芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因、D型乳酸脱氢酶的编码基因和NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因。利用本发明所构建的产D‑苯乳酸的基因工程菌生产D‑苯乳酸，具有以下优点：构建了一个辅因子循环体系，增加还原力的供应；使用谷氨酸、α‑酮戊二酸等添加物提高了辅因子循环效率，进而进一步提高了D‑苯乳酸的合成量；全细胞催化方法简化了D‑苯乳酸生产过程，生产周期短，因而将在今后的D‑苯乳酸的生产中占据了重要的地位。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种产D-苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

D-苯乳酸是一种新型的生物防腐剂，具有抑菌谱宽(对革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌和真菌均具有抗菌活性)，理化性质好等优点。D-苯乳酸有着广泛的应用，比如，在食品行业，可以作为乳制品的添加剂，用于杀死其中的食源性致病菌，也可以应用于烘焙，抑制通过食品传播的各种霉菌，还可以被添加于饲料中，取代经典的抗生素；在药品行业，可以替代丹参，用于冠心病的临床治疗；也可以被添加于皮肤病治疗药物中，减少皮肤皱纹；在化妆品行业，具有除皱、亮肤的美容功效。自然界中，D-苯乳酸广泛存在于蜂蜜中，同时能够被多种微生物产生，特别是乳酸细菌。在乳酸细菌中，D-苯乳酸的合成主要来自于L-苯丙氨酸的分解代谢：L-苯丙氨酸首先经氨基转移酶(tyrosine aminotransferase，TyrB，EC:2.6.1.57)催化生成苯丙酮酸，苯丙酮酸再通过D型乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,D-LdhD，EC:1.1.1.28)作用合成D-苯乳酸。

目前，D-苯乳酸主要是由乳酸菌生产，通过高产菌的筛选，发酵条件的优化以及分离提取的改进，D-苯乳酸的产量有了较大的提高。但现今高产D-苯乳酸的菌株主要采用苯丙酮酸作为底物，该物质的化学性质不稳定，且费用较高，故用于大规模生产的成本太贵。

值得一提的是，在以L-苯丙氨酸为底物的D-苯乳酸合成过程中，将苯丙酮酸还原为D-苯乳酸需要提供NADH作为还原力。目前的研究主要是通过共表达甲酸脱氢酶(FDH)或者葡萄糖脱氢酶(GDH)同时在全细胞催化体系中添加大量的甲酸和葡萄糖，通过将甲酸(葡萄糖)在甲酸(葡萄糖)脱氢酶的作用下生成二氧化碳(葡萄糖酸)同时合成NADH作为辅因子的供体。这种方式为D-途径苯乳酸合成途径提供NADH存在两个问题：1、需要在反应体系中额外添加物质，提高了成本；2、产生副产物，可能对于D-苯乳酸的分离带来困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种产D-苯乳酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

本发明所提供的制备产D-苯乳酸的基因工程菌方法，具体可包括如下步骤：将与D-苯乳酸合成相关的基因导入宿主菌得到产D-苯乳酸的重组菌；所述与D-苯乳酸合成相关的基因为芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因、D型乳酸脱氢酶的编码基因和NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶的编码基因。

其中，所述宿主菌可为大肠杆菌或大肠杆菌的基因敲除突变体。所述大肠杆菌的基因敲除突变体可为敲除大肠杆菌中苯乙醛脱氢酶的编码基因(feaB)和过氧化物酶的编码基因(katG)中的至少一个基因后得到的突变体。

所述苯乙醛脱氢酶的编码基因(feaB)的核苷酸序列如序列表中序列11所示；所述过氧化物酶的编码基因(katG)的核苷酸序列如序列表中序列12所示。

在本发明中，所述大肠杆菌具体为大肠杆菌BW25113、大肠杆菌BW25113ΔfeaB或大肠杆菌BW25113ΔkatG。

在所述方法中，所述芳香族氨基酸氨基转移酶具体可为如下任一：

(a1)氨基酸序列为序列表中的序列1的蛋白质；