[发明专利]一种鲜冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法及应用

说明书

本发明属于中药材指纹图谱领域，具体涉及一种鲜冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法，及其该方法在鉴别冬虫夏草中药材中的应用。该方法是将样品进行前处理后按如下色谱条件利用液质联用LC‑Q‑TOF‑MS技术进行测定：所述的色谱条件为：色谱柱：Welch Xtimate C4；填充剂：四烷基硅烷键合硅胶；流动相：A为0.1％甲酸‑水，B为0.1％甲酸‑乙腈；梯度洗脱。本发明的结果表明与现有技术相比具有以下优点和积极的效果：首次采用LC‑Q‑TOF‑MS技术建立了冬虫夏草蛋白质指纹图谱，同时确定了样品蛋白提取条件和分析条件的最优参数，灵敏度高，分离效果好，提高了结果的准确性和可靠性。最后将蛋白指纹图谱应用于冬虫夏草真伪鉴别中，可为冬虫夏草的质量控制提供参考。

技术领域

本发明涉及中药材指纹图谱领域，具体涉及一种鲜冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法，以及该方法在鉴别冬虫夏草中药材中的应用。

背景技术

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。性味甘，平，归肺、肾经，具有补肾益肺，止血化痰疗效，用于治疗肾虚精亏，阳痿遗精，腰膝酸痛，久咳虚喘，劳嗽咯血等。现代研究表明冬虫夏草含有核苷、蛋白质、多糖、甾醇等活性物质，具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗衰老等活性。

冬虫夏草是一味珍稀中药材，近年来市场需求逐渐增大，而资源却十分匮乏，导致价格高昂，使得市场上掺杂品、混淆品、伪品增多。于是解决冬虫夏草真伪鉴别问题便成为一个急迫的问题，目前虽有王君等报道的《HPLC指纹图谱在鉴别冬虫夏草上的应用》对冬虫夏草、蛹虫草和假虫草进行了鉴别，以及张薇薇等报道的《人工虫草与冬虫夏草HPLC特征图谱研究》对冬虫夏草、人工北虫草、发酵虫草菌粉等进行了鉴别，而蛋白质作为冬虫夏草的一种活性成分，将其蛋白质指纹图谱用于冬虫夏草真伪鉴别却是一片空白。

本发明突破了常规的限制，利用蛋白质大分子的蛋白质指纹图谱代替传统的小分子的指纹图谱对冬虫夏草进行真伪鉴别。现有的蛋白质指纹图谱技术多采用凝胶电泳技术，如双向电泳(如钱正明等人的《冬虫夏草蛋白图谱及干燥条件对超氧化物歧化酶活性影响》)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(如朱雪飞等人的《五种不同苜蓿的种子蛋白指纹图谱研究》)和酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)技术(如郎明林等人的《中国北方麦冬区主栽品种醇溶蛋白指纹图谱数据库的建立》)，其存在的缺点是：所用试剂多为有毒试剂、样品准备与制胶过程繁琐、耗时，凝胶图谱重复性差、专属性差。另外，药典中关于阿胶的鉴定使用到高效液相色谱-质谱法(2015版《中国药典》189页)，但其前处理麻烦，需要用酶解12h，而本发明无需酶处理，更加简便。目前，MALDI-TOF-MS成为蛋白质指纹图谱分析的热点技术，其灵敏度高、精确、重现性好，但是仪器价格昂贵，样品前处理耗时，目前多用于研究病原微生物、动物和人体的蛋白质指纹图谱和蛋白质组学，鲜有用于研究中药材的蛋白质指纹图谱。

发明内容

本发明所提供的LC-Q-TOF-MS技术具有快捷、简便、易行，样品用量小和高通量分析等特点，且样品前处理简单，可最大程度的保护样品的蛋白成分。同时所建立的方法可用于鉴别冬虫夏草中药材的真伪，为临床用药的安全、有效提供准确的参考依据。

本发明的目的是建立一种冬虫夏草蛋白质指纹图谱的方法及其该方法在鉴别冬虫夏草真伪中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明公开了一种冬虫夏草的蛋白质指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备冬虫夏草供试品溶液；

(2)使用LC-Q-TOF-MS技术测定供试品溶液得到蛋白质指纹图谱，其中，

高效液相色谱条件：所用的色谱柱为反相色谱柱，所述的反相色谱柱的填充剂为烷基键合硅胶；流动相A为0.1％甲酸-水，流动相B为0.1％甲酸-乙腈；