[发明专利]抗Ki-67蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗体

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株（3F2），以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。本发明所述单克隆抗体可与Ki‑67蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了Ki‑67蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可以识别Ki-67蛋白质分子的小鼠单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

Ki-67是一种标志着细胞周期进展及增殖期细胞的核抗原基因，其表达仅限于细胞增殖周期的G1、S、G2期和M期，且在G0期表达缺失。Ki-67过度表达提示细胞处于细胞周期的增殖期。作为一种存在于增值细胞中的核抗原，Ki-67的确切功能尚不清楚，但通过研究它的表达及在核内分布的情况，认为它的功能与染色质相连与细胞有丝分裂有关，因此是目前应用最广泛的细胞增殖标记之一。

Ki-67抗原是目前多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研究中的热门生物指标，可以通过Ki-67抗原的检测，了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。肿瘤增殖Ki67表达范围覆盖除G0 期以外的各增殖周期细胞。研究结果提示PCNA 和Ki67 均可较好地用于检测乳腺癌组织中的增殖细胞，二者基本可以互为代替使用。由于Ki67 在G0 期以外各增殖周期均有表达，更具可用性。两者具有一定的互补性。Ki-67在低分化腺癌组织中的表达较在中高分化腺癌组织的表达明显升高，表明Ki67 染色阳性程度与组织学分级的相关性。表明Ki67表达与乳腺癌发生、发展有关,是一个不良预后因素，对乳腺癌的诊断治疗及预后评价有重要的参考价值。

目前临床上主要通过免疫组织化学（IHC）病理实验检测肿瘤组织中Ki-67蛋白的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合Ki-67蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对Ki-67蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗Ki-67蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗Ki-67单克隆抗体。本发明所述小鼠单克隆抗体可与Ki-67蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了Ki-67蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内Ki-67蛋白表达水平。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明对Ki-67分子，按照公开的序列进行分析，依据在细胞内的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达。经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-28a中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫ICR小鼠。经细胞融合、重组Ki-67筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用ICR小鼠进行腹水制备，亲和层析纯化腹水，获得小鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG2a型单克隆抗体，亲和常数为1.91×10⁹。免疫印迹（Western blotting）实验显示该抗体能特异识别重组Ki-67蛋白以及表达Ki-67分子的肿瘤细胞。

为达到上述目的，本发明的具体技术方案如下：

所述抗Ki-67单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系3F2分泌。

获得所述抗Ki-67单克隆抗体时免疫ICR小鼠用的抗原为重组Ki-67抗原蛋白，所述重组Ki-67抗原蛋白经大肠杆菌重组表达而获得。

所述重组Ki-67抗原蛋白包括以下一个或几个部分：具有抗原性的Ki-67片段和用于纯化重组蛋白的标签蛋白。

所述Ki-67片段为162个氨基酸蛋白序列，所述蛋白标签为6个组氨酸。

所述抗Ki-67单克隆抗体为大鼠IgG2a亚型单克隆抗体。