[发明专利]一种基于直接竞争荧光免疫法定量检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法

权利要求书

1.一种基于直接竞争荧光免疫法定量检测叶酸功能化二氧化硅（SiO₂-FO）靶向纳米药物载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a、SiO₂-FO包被抗原和免疫原的制备；

b、抗SiO₂-FO抗体的制备；所述抗SiO₂-FO抗体的效价为1:64000；

c、荧光抗体的制备；

d、将SiO₂-FO包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的SiO₂-FO标准品，以FITC标记的抗SiO₂-FO抗体作为一抗，建立直接竞争荧光免疫分析定量检测SiO₂-FO；

e、以SiO₂-FO标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线SiO₂-FO标准品浓度的对数为横坐标，荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线；

所述标准曲线的线性方程为A=12434.4-1136.7logC，其中A为荧光强度值，C为SiO₂-FO浓度；

所述步骤a具体包括以下步骤：

a-1、称取10~20mg SiO₂-FO溶于1~2mL PBS溶液中，磁力搅拌1~2h即得到水溶性的SiO₂-FO溶液；

a-2、称取10~20mg OVA溶于2~4mL PBS溶液中,并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO₂-FO溶液，混合均匀后再滴加80~200μL 25%戊二醛溶液，25~28℃下避光搅拌2~5h；将反应液置于透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO₂-FO包被抗原，其浓度为2~4mg/mL；

a-3、称取10~20mg BSA溶于2~4mL PBS溶液中，并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO₂-FO溶液，混合均匀后再滴加80~200μL 25%戊二醛溶液，25~28℃下避光搅拌2~5h；将反应液置于透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO₂-FO免疫原，其浓度为2~4mg/mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，透析袋的截留分子量为8000~14000Da。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，水溶性的SiO₂-FO溶液浓度为5~15mg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b具体包括以下步骤：

b-1、首次免疫：将SiO₂-FO免疫原与弗氏完全佐剂等体积比混合后，采用背部皮下多点注射的方式注射到大白兔体内，注射8~10个点，注射量为1~2mL/只；首次免疫三周后进行加强免疫；

b-2、加强免疫：将SiO₂-FO免疫原与弗氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到大白兔体内，注射8~10个点，注射量为1~2mL/只；此后每两周进行再次加强免疫，中间周进行耳静脉采血测血清效价，直到效价达到1:64000，再进行最后一次加强免疫，并在免疫一周后从动物颈动脉采血，静置析出抗血清并进行纯化，得到抗SiO₂-FO抗体，其浓度为15~20mg/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c具体包括以下步骤：

c-1、取纯化后的抗SiO₂-FO抗体，用碳酸盐缓冲液稀释至每毫升内含蛋白8~15mg，制得抗体溶液；

c-2、将异硫氰酸荧光素（FITC）溶解在碳酸盐缓冲液中，制成浓度为2mg/mL的FITC溶液；

c-3、在25~28℃下将FITC溶液缓慢加入步骤c-1得到的抗体溶液中，磁力搅拌4~6h；

c-4、将步骤c-3得到的溶液用葡聚糖凝胶进行过滤纯化，得到FITC标记的抗SiO₂-FO抗体。