[发明专利]一种低聚龙胆糖的制备方法

说明书

本发明公开了一种低聚龙胆糖的制备方法，属于发酵工程技术领域。本发明以葡萄糖和纤维二糖为底物，以β‑葡萄糖苷酶为催化剂合成低聚龙胆糖。本发明以20％葡萄糖和40％纤维二糖为底物，加入β‑葡萄糖苷酶400U/g纤维二糖，在pH5、温度60℃下进行酶反应，反应周期为31h，低聚龙胆糖的产量能达到116g/L，转化率为19.4％。此外，本发明将绿色木霉来源的β‑葡萄糖苷酶异源表达到毕赤酵母中，得到一种高产β‑葡萄糖苷酶基因工程菌毕赤酵母KM71/pPIC9K‑bgl1。本发明菌株生产的β‑葡萄糖苷酶的最适pH为5、最适温度为60℃，酶活能达到1020U/ml，适合用于低聚龙胆糖的制备。

技术领域

本发明涉及一种低聚龙胆糖的制备方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

低聚龙胆糖是葡萄糖以β-1，6糖苷键结合而形成的新型功能性低聚糖，包括龙胆二糖，少量的三糖和四糖。低聚龙胆糖不被人体的酶所降解，低热量，适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用；其还具有高保湿性和吸湿性，有利于保持食品中的水分，可防止淀粉类食品的老化；同时低聚龙胆糖pH和热稳定性高，适用于高温和特殊pH条件下使用的食品；其水活性低，可以有效的防止食品被微生物污染；还具有柔和的提神苦味，可以添加在食品中增加口味的丰富性。目前，低聚龙胆糖被广泛的运用于巧克力、冰淇凌、咖啡、调味品、烘烤食品和饮料中。

制取低聚龙胆糖方法较多，早期的研究从龙胆属植物的根、茎中提取，也可以利用还原苦杏仁苯法和酸法水解淀粉后从其副产物中提纯获得；但由于原料、市场价格等的限制，使其难以工业化生产。目前利用酶转化方法生产低聚龙胆糖的研究集中在以高浓度的葡萄糖为原料，利用β-葡萄糖苷酶的逆水解活性合成低聚龙胆糖。但得到的低聚龙胆糖产量都不高，基本上都是在50g/L，转化率在8％左右。

β-葡萄糖苷酶又叫β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶。广泛存在于植物、动物和微生物中，其中微生物来源更为广泛，在原核微生物中有约氏黄杆菌，真核微生物中有清酒酵母、黑曲霉等，但是这些菌株产β-葡萄糖苷酶用于生产低聚龙胆糖时产量较低。因此，本发明的目的不仅在于提高低聚龙胆糖的产量及转化率，还要构建一种适用于低聚龙胆糖生产的基因工程菌。

发明内容

β-葡萄糖苷酶能水解非还原性β-D-糖苷键，游离β-D-糖苷键和配基。同时β-葡萄糖苷酶也具有转糖苷活性，可以将水解活性释放出的配基或葡萄糖体，以β-1，6糖苷键形式转移到其他糖底物上。

本发明的第一个目的是提供一种低聚龙胆糖的制备方法，所述方法是以葡萄糖和纤维二糖为底物，以β-葡萄糖苷酶为催化剂合成低聚龙胆糖。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的反应条件为以终浓度为5-30g/100mL的葡萄糖和终浓度为10-60g/100mL的纤维二糖为底物，β-葡萄糖苷酶加酶量为100-500U/g纤维二糖，在pH4-6、温度50-70℃下进行酶反应，反应周期为24-48h。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖和纤维二糖的摩尔比为1:1。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的反应条件为以终浓度为20g/100mL的葡萄糖和终浓度为40g/100mL的纤维二糖为底物，β-葡萄糖苷酶加酶量为400U/g纤维二糖，在pH5、温度60℃下进行酶反应，反应周期为31h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示β-葡萄糖苷酶基因连接到表达载体pPIC9K上，导入毕赤酵母KM71中获得的基因工程菌，经发酵后得到的β-葡萄糖苷酶作为催化剂。

本发明的第二个目的是提供一种β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母基因工程菌，所述毕赤酵母基因工程菌发酵得到的β-葡萄糖苷酶应用于上述低聚龙胆糖的制备方法中。