[发明专利]一种基于二甲基化标记DIA策略的蛋白质定量方法

说明书

本发明涉及一种基于标记的DIA定量方法。它是利用二甲基化反应标记肽段，通过二甲基化标记试剂各种同位素形式有机组合实现肽段样品的多重标记，利用数据非依赖(DIA)采集模式采集数据，提取每重标记相应的DIA数据中多条母离子和子离子的提取离子色谱图，利用提取到的峰面积进行蛋白质的多重定量分析。该方法的优势在于：定量准确度高，重现性好，标记效率高，方法简单，对液质系统重现性要求较低，易于进行样品多维分离，蛋白质组定量分析的通量高。本发明通过标记提高DIA策略的定量准确度及通量，在大样本蛋白质组分析中具有明显的优势。

技术领域

本发明涉及一种基于标记的DIA定量方法，通过标记提高DIA策略的定量准确度及通量。该方法具有定量准确度高，重现性好，标记效率高，方法简单，对液质系统重现性要求较低，易于进行样品多维分离，蛋白质组定量分析的通量高等优点。在大样本蛋白质组分析中具有明显的优势。

背景技术

近些年，生物学、精准医学越来越多的需要蛋白质组学数据，其大样品量对蛋白质组方法的重现性和通量提出了越来越高的要求。常规的数据依赖采集模式下，母离子采集的随机性会造成肽段鉴定的重现性差。因此，近年来，数据非依赖(DIA)的采集模式已经得到了广泛的关注。它的主要优势在于可以实现信息的无损采集，且数据之间具有很高的重现性。但是相应的问题就是二级谱图是大量肽段共碎裂的混合谱图，给后续数据分析提出了更高的难度。目前常用的DIA数据处理采取的策略是类似于MRM的母子离子对提取的策略。但由于每张DIA二级谱中碎片离子数众多，故影响定量准确度，因此提高DIA数据分析准确性具有重要意义和挑战。此外，目前常见的定量方法是基于无标记的策略(Mol.Cell.Proteomics 2012,11,O111 016717.)，标记策略目前仅有基于NeuCoDIA的标记技术(Anal Chem.2015,87,2570.)，但目前通量普遍较低。

发明内容

本发明发展了一种基于二甲基化标记DIA策略的蛋白质定量方法，利用二甲基化反应标记肽段，通过二甲基化标记试剂各种同位素形式有机组合实现肽段样品的多重标记。采用数据非依赖(DIA)采集模式提取相应的母子离子对的提取离子色谱图，实现高通量、高重现性的精确蛋白质组定量。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1、蛋白质样品经过变性还原烷基化后，按照一定的酶/蛋白比例加入蛋白酶，包括胰蛋白酶、Lys-C酶、Lys-N酶、Glu-C酶、Arg-C酶、Asp-N酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K的一种或多种，孵育过夜。

2、对待测样品酶解所得肽段分别进行不同同位素标记的二甲基化反应。碱性条件控制pH值为7.5～12，标记时间0.5～12h。

3、对进行相对定量分析的大样本或者基于内标物的绝对定量分析的待测样品和内标物进行多重标记，五重标记试剂选择为：

1-plex：CH₂O+NaBH₃CN(Dim28)；

2-plex：CH₂O+NaBD₃CN(Dim30)；

3-plex：¹³CH₂O+NaBD₃CN(Dim32)；

4-plex：¹³CD₂O+NaBH₃CN(Dim34)；

5-plex：¹³CD₂O+NaBD₃CN(Dim36)。

4、将多重标记样品混合。如分析样品复杂度高，兼容蛋白质组中的二维分离策略。