[发明专利]一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法

说明书

技术领域

本发明属于生物冻存技术领域，具体涉及一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法。

背景技术

人类活性免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。人类活性免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。人类活性免疫细胞包括吞噬细胞和淋巴细胞，淋巴细胞中的T细胞、B细胞是发挥特异性免疫的主要细胞群。从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。

目前人类活性免疫细胞的培养主要应用于肿瘤细胞免疫治疗。肿瘤细胞免疫治疗是采集人体自身活性免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。肿瘤自体细胞免疫疗法适用于多种实体肿瘤，包括恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等实体瘤手术后防止复发，也可以用于多发性骨髓瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系统恶性肿瘤的复发，对于大多数细胞免疫治疗的适应人群还可以用于上述肿瘤的进一步巩固治疗，达到延长生存期、提高生活质量和抑制肿瘤恶化的目的。

常见的人类活性免疫细胞治疗种类包括NK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞、CART细胞等。所有这些经诱导和扩增培养的免疫细胞，他的初始细胞来源都是外周血或脐血的单个核细胞，而且是直接分离培养。随着年龄的增长，人类活性免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障。因此人类活性免疫细胞冻存及冻存后的复苏培养具有非常大的意义。

目前，细胞冻存主要是采取-196℃超低温条件下的保存方案，在超低温条件下，细胞的代谢功能停滞，但并未死亡。而细胞复苏则主要采用冻存细胞在37℃快速解冻的方法，以恢复细胞的活性和功能。影响免疫细胞冻存和复苏活性的主要因素包括冷冻及复苏的方式和冷冻剂的选择。造成细胞损伤的两种因素一种是细胞内冰晶形成和重结晶，一般是由不适当的降温程序导致；另一种是溶质损伤，一般是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所致，冷冻保护剂可以避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。现有的免疫细胞冻存液存在以下技术问题：(1)现有的冻存液所使用的培养基主要有天然培养基和基础培养基两种。天然培养基主要以动物血清(小牛血清、马血清等)为主，基础培养基在人工合成时还需添加一定量的血清使细胞生长和繁殖，但是只要加入血清，就会引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。(2)冻存液中的渗透性冷冻保护剂主要有二甲基亚砜、甘油、乙二醇和丙二醇，其中，以二甲基亚砜效果最好，但是二甲基亚砜对细胞的毒性作用较大，影响细胞的活性，对细胞复苏后的洗脱要求很高。(3)冻存管在冷冻过程中，降温程序单一，通常是在冰箱中冷冻至-80℃后转移至液氮罐中，此过程中降温速率一致，缺乏对细胞悬液中相变过程中的计算考虑，容易出现冰晶损伤和溶液损伤。以上三个技术问题，严重影响了细胞复苏后的活性和存活率。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明提供一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法，该冻存液中不含血清，能够最大限度的降低二甲基亚砜的毒性，同时对冻存方法进行优化，共同提高细胞的存活率和活性。

本发明所述的一种一种人类活性免疫细胞冻存液，其特征在于：包含二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、无血清细胞培养基，其中，所述的无血清细胞培养基为SAF-CHO-G-001细胞培养基。

其中，优选方案如下：

本发明冻存液的配方可以按体积百分比计算，包含5～10％二甲基亚砜、5～10％乙酰胺、5～10％右旋糖酐、70～85％无血清细胞培养基。

优选按体积百分比计算，包含8％二甲基亚砜、8％乙酰胺、8％右旋糖酐、76％无血清细胞培养基。

也可以优选按体积百分比计算，包含10％二甲基亚砜、5％乙酰胺、10％右旋糖酐、75％无血清细胞培养基。

本发明所述的人类活性免疫细胞的冻存方法，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)将二甲基亚砜、乙酰胺、右旋糖酐、无血清细胞培养基按比例混匀制得冻存液；