[发明专利]PDGFRβ单克隆重链抗体杂交瘤细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了PDGFRβ单克隆重链抗体杂交瘤细胞及其制备方法和应用。该制备方法包括如下步骤：(1)制备免疫原，所述的免疫原的结构通式为：PDGFRβ胞外区域‑恒定区Fc；(2)利用免疫原免疫HCAb小鼠；(3)对HCAb小鼠进行1～7次加强免疫；(4)制备HCAb小鼠的脾细胞悬液并与小鼠骨髓瘤细胞融合得杂交瘤细胞；(5)鉴定杂交瘤细胞。将该杂交瘤用于PDGFRβ单克隆重链抗体的制备成本低、步骤简便，且抗体性质优异，能与人PDGFRβ的胞外区相结合，并高效抑制或阻断PDGFb与PDGFRβ结合，从而下调或切断相应的信号通路。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及重链抗体转基因小鼠杂交瘤细胞及单克隆抗体的制备方法。

背景技术

血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)是普遍存在的一种由sis原癌基因编码的生长因子，最初从血小板α中分离得到，主要由巨核细胞合成，在组织损伤修复，血管生成和细胞分化过程中起到非常重要的作用。PDGF分子是一个糖蛋白二聚体，可分为-AA，-BB和-AB三种类型。PDGF及其受体(Platelet-derived growth factorreceptor,PDGFR)在多种人体肿瘤中都有比较高的表达，如胰腺癌、小细胞肺癌、胃癌和乳腺癌等。PDGFR是一种位于细胞表面的受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)，可分为两个亚型：PDGFRα和PDGFRβ(Matsui et al.1989)。PDGFRβ可以特异性的与PDGF-BB或-AB结合(Herdaran et al.1991)而被激活。被激活后，两个PDGFR之间可以形成二聚体，并通过自身磷酸化激活下游的信号转到通路，以实现其调控细胞分化生长的功能。PDGF信号传递已经在多种人类疾病中涉及，包括与病理学新血管形成相关的疾病、血管和纤维化疾病、肿瘤生长和眼病。因此，已经提出PDGF信号传递的抑制剂用于多种治疗环境。例如，已经提议将PDGFRβ的抑制剂用于治疗多种疾病和病症。(Andrae等人(2008)Genes Dev 22(10):1276-1312)。PDGFRβ抑制剂包括非特异性小分子酪氨酸激酶抑制剂诸如甲磺酸伊马替尼、苹果酸舒尼替尼和CP-673451，以及抗PDGFRβ抗体(参见，例如美国专利号7,060,271；5,882,644；7,740,850；和美国专利申请公开号2011/0177074)。也已经提出将抗配体适配体(例如抗PDGF-B)用于治疗应用。然而，本领域存在对新的、高特异性和强有力的PDGF信号传递抑制剂的需求。

目前的单克隆抗体大多来自于小鼠，因此抗体作为异源蛋白在人体内具有抗原性，极大地限制了它在临床治疗上的使用。为了克服这一缺点，人们提出了很多解决方案，包括人/人或人/鼠杂交瘤技术、嵌合抗体技术、噬菌体展示技术。人/人或人/鼠杂交瘤技术由于其技术难度已退出市场，现在主要是运用体外抗体工程方法制备人源化抗体，但是这类方法得到的抗体往往亲和力不佳，易聚集，而从体内制备人源化或全人源抗体具有高亲和力，良好的水溶性以及不易发生聚集的优点，因此从全人源抗体转基因小鼠制备人全源抗体最具有研发优势，也是今后抗体开发的主流。重链抗体是去除两条轻链的抗体，相比传统抗体，它更容易穿过血管壁和进入实体瘤内部，在研发抗肿瘤单抗药物方面更具优势，另外从重链抗体衍生而来的单域抗体是迄今为止发现的最小抗体分子，在肿瘤影像，治疗和诊断方面可得到广泛应用。基于重链抗体的模块化性质，更进一步的应用是制备同时针对两个不同靶抗原的双特异抗体。然而，目前最常用的产重链抗体的技术为免疫骆驼通过噬菌体展示筛选得到抗体，其成本较高，后期仍需进行人源化才能得到全人源的重链抗体，因此探索成本低、效率高、且所得抗体亲和力好、特异性高的单克隆重链抗体具有重要意义。

发明内容