[发明专利]一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒，本发明的引物组合中的每对引物均可从BRCA1或BRCA2基因至少一个外显子所在区域扩增得到一个特征片段，特征片段长度各不相同，经过优化后，引物分为5组，进行多重PCR扩增，每组扩增产物的长度均具有差异。多重PCR以GeXP‑PCR方式进行，PCR反应前期为特征片段的线性特异扩增，后期以通用引物对特征片段进行无差别扩增。通用引物中的一条带上适宜的荧光修饰基团，即可于相应的毛细管电泳分析仪器上进行分析，获得各特征片段的相对含量信息，进而获得相应基因区域的大片段重组突变信息。本发明所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点，与普通的终点法多重PCR相比，解决了多重扩增偏好性问题，提高了可靠性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合、方法及试剂盒。

背景技术

BRCA1和BRCA2是重要的抑癌基因，参与染色体损伤修复过程。BRCA1和BRCA2的突变可能造成基因功能的降低或缺失，进而增加细胞癌变的风险。现有的数据显示，这两个基因的胚系突变是造成遗传性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突变携带者一生中罹患乳腺癌的几率可高达87％，卵巢癌的几率可高达44％。因此，对高危人群进行BRCA1/2基因突变检测，对于癌症的预防，发现和治疗有着重要的指导意义。

BRCA1/2的突变分为两种。第一种是单个碱基的突变或少量碱基的缺失和插入，可以造成氨基酸序列的改变，翻译提前终止，或信使RNA加工的异常，进而影响蛋白的功能。第二种是大片段DNA重组，可以造成一个或多个外显子的缺失或重复，从而扰乱基因功能。这两种突变中，第一种占大部分，并且可通过基因片段PCR扩增和Sanger测序相结合的常规方法进行检测。第二种占少部分，需要通过Southern杂交，多重连接探针扩增技术MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)，定量PCR或CGH(comparativegenomic hybridization)等较为复杂的方法来检测。第二代高通量测序技术也被运用到了BRCA1/2突变的检测中。通过高通量测序，两种类型的突变可以被同时检测。但是，利用二代测序技术进行大片段DNA重组的检测，对基因组目的区域的富集方式、测序深度和信息分析等都有特定的要求，对于很多实验室现有的检测平台来说都是非常大的挑战。所以，一种快速有效的BRCA1/2大片段重组检测技术，无论是作为独立的大片段重组检测项目，还是作为常规点突变检测的补充，都有非常重要的应用价值。

BRCA1和BRCA2共有48个外显子。用Southern杂交或实时定量PCR来检测工作量大。CGH可同时检测整个基因区域，但对技术平台有很高的要求。以多重PCR为基础的检测技术操作简单，方便快捷。MLPA技术被广泛用于BRCA1/2及许多其它基因大片段DNA重组的检测，目前还存在数据变异较大的缺点，检测精确度有待提高。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明针对BRCA1和BRCA2的所有外显子开发了一套引物，根据产物片段大小，将一套引物分为五组，利用GeXP原理，通过五组引物对待测样本进行多重扩增。利用五组引物进行多重PCR的产物片段大小分布在180至500bp的范围之间。利用一条通用引物上的荧光修饰使所有扩增片段一端带上荧光基团，通过毛细管电泳DNA分析仪进行片段分析后，通过片段大小识别特征片段，通过峰高判定每个外显子所在区域的扩增强度，进而判断各外显子在基因组中的拷贝数和相应区域的大片段重组情况。本发明所提供的检测方法具有操作简单，成本低廉的优点。

为实现本发明的技术目的，本发明第一方面提供一种用于检测BRCA1和BRCA2基因大片段重组的引物组合，所述引物组合包括：

从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因的各个外显子所在区域的特征片段的多对引物中获得五个引物组；