[发明专利]抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法

说明书

技术领域

本发明属于抗体检测技术领域，尤其涉及一种抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法。

背景技术

酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是目前现有最常用的抗体检测技术，其基本方法是将已知的抗原吸附于固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，通过固相载体表面的抗原与待检测抗体的结合；再加入酶标记的二抗(针对不同的种属，人，猴，小鼠)来进一步识别与抗原结合的抗体，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行；再加入底物后二抗上标记的酶基团介导一个颜色反应，通过分光光度计读取吸光度后即可获得读数，以此判断样品中是否存在识别吸附于固相载体表面抗原的抗体。通过酶联免疫法(ELISA)方法来进行抗体检测有以下几个缺点：1.用于检测用的重组抗原需要在细菌或其他重组蛋白表达系统中进行表达，然后进行纯化才可用于包被聚苯乙烯板的固相表面，因此难以应用于一些疏水性较强，或具有多次跨膜结构的抗原表达纯化，导致难以开发出相应抗体的检测方法2.需要通过化学偶联的方式，将报告基因蛋白(如辣根过氧化物酶)偶联标记至重组抗原或抗体上形成酶标抗原或者酶标抗体进行检测，而化学偶联的方式将增加额外的生产步骤和生产成本，同时可能由于所发生化学偶联反应而影响抗原与抗体的结合。3.酶联免疫吸附法一般需使用特定的抗原或者抗体来吸附于检测用的聚苯乙烯板的固相表面，针对不同抗原的检测试剂盒需要使用相应的抗原或者抗体来预先吸附聚苯乙烯板，不同试剂盒之间不能共用，因此包被聚丙乙烯板工作繁琐。4.针对不同物种来源的检测血清样本(如人，鼠，猴，猪，鸡)，需要针对性的使用不同物种抗体的二抗，导致所开发的试剂盒具有种属特异性无法无差别应针对同一抗原但来源于不同物种抗体的检测(如鸡的禽流感抗体检测试剂盒无法应用于人的禽流感抗体检测)。

综上所述，现有技术存在的问题是：针对同一种抗原的ELISA试剂盒无法应用与不同的动物(即种属特异性)，对于某些特定的跨膜抗原因无法表达纯化，因此无法开发出酶联免疫法的抗体检测试剂盒。现有的酶联免疫法所使用的重组抗原纯化过程及与酶进行偶联的过程繁琐，且可能对抗原或抗体存在影响。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法。

本发明是这样实现的，一种抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法，所述抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法通过蛋白质工程的手段将报告基因的编码核酸序列直接与抗原编码核酸的序列通过基因工程改造的方式连接为一个单一的重组基因，再通过化学转染或电转染等方式导入真核或原核细胞并表达为一个重组蛋白(即酶融合抗原)；直接使用表达酶融合抗原的细胞或真核或原核裂解物作为检测用抗原；使用抗体捕获蛋白包被聚苯乙烯板。

进一步，所述抗体捕获蛋白包括：链球菌蛋白A，蛋白G，重组蛋白A/G，蛋白L或以抗体作为免疫原刺激动物产生针对抗体的普通二抗。

进一步，所述抗体捕获蛋白及报告基因融合重组蛋白检测抗体的方法包括以下步骤：

步骤一，使用抗体捕获蛋白包被检测板的固象表面(聚苯乙烯板或具有蛋白吸附能力的材料)；

步骤二，使用抗体捕获蛋白吸附与载体固相表面后，使用无关蛋白进行封闭，将检测板固相表面上未吸附抗体捕获蛋白的表面进行封闭从而避免非特异性吸附的产生；

步骤三，将报告基因的核酸序列与抗原(或抗原表位)编码基因的核酸序列通过分子克隆的方式连接为一个单一的核酸序列，使报告基因和抗原(抗原表位)表达为一个单一的融合重组蛋白(即酶融合重组抗原)作为检测用抗原使用；

步骤四，将表达报告基因融合重组抗原(酶融合抗原)的细胞使用适当的方法破碎裂解，部分原核细胞难以表达的蛋白可使用真核细胞表达系统进行表达；

步骤五，将待检测样本以1:20的比例加入含有重组抗原的裂解液中混合后，加入抗体捕获蛋白包被，无关蛋白封闭的检测板的孔中进行孵育；

步骤六，样本中所有抗体首先被抗体捕获蛋白所捕获吸附与检测板的固象表面，吸附于固相表面的抗体中若含有可识别重组酶融合抗原的抗体，则可捕获细胞裂解液中携带报告基因的重组酶融合抗原；

步骤七，通过洗涤法去除液相中未被抗体识别的重组酶融合抗原及细胞裂解物，加入酶融合抗原上的报告基因(即酶活性基团)所识别的底物进行反应，通过检测报告基因的活性，确认样本中是否含有针对重组蛋白的抗体。