[发明专利]塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域的检测方法，具体涉及一种塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测特异性引物、探针及检测方法。

背景技术

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)为单股正链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科(picornaviridae)Senecavirus病毒属。SVV最初是2002年在PER.C6细胞培养物中被发现，2007年认定SVV为导致美国一批屠宰场中的猪群出现水疱症状的致病原，直到2015年才出现新的报道，巴西和美国均爆发了多起SVV疫情，多个阶段的猪只均能感染，鼻镜、唇部和蹄部等部位出现水疱，并导致小天龄仔猪死亡，造成较大的损失。随后有报道显示国内也出现了塞尼卡谷病毒，由于之前国内从来没有出现过，因而没有现成的检测方法，直至目前国内仍少见塞尼卡谷病毒的检测方法，主要原因是该病为新病，相关研究较少，已有的RT-PCR检测方法只能进行定性检测不能做精确定量分析，且扩增后需要经过电泳判断结果，每次检测的样品数量较少、对低含量的样品分辨率不足等缺点。

由此可见，现有技术还有待改进。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法，具有实时、快速、灵敏度高、特异性和稳定性好等优点，有利于较大规模的定量检测分析。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测引物，其核苷酸序列为：

上游引物：5’-TTATAGAATTTGGAAGCCATGCT-3’(SEQ ID NO:1)

下游引物：5’-ATCAGAATGCAGCTTCTCGAGTAG-3’(SEQ ID NO:2)。

一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测探针，其核苷酸序列为：

5’-CCTACTTCAAACCAGGAAC-3’(SEQ ID NO:3)。

进一步的，所述探针的5’端标记荧光报告基团(FAM)；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(NFQ)。

一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法：

(1)制定塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线；

(2)提取样品中的病毒RNA，-20℃～-80℃冷冻保存备用；

(3)将(2)中的样品病毒RNA进行逆转录，所得逆转录cDNA产物-20℃～-80℃冷冻保存备用；

(4)将(3)所得的样本cDNA产物作为模板进行TaqMan-MGB荧光定量PCR反应；

(5)结合步骤(1)中的标准曲线，判读检测结果。

进一步的，所述TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法步骤(1)中，塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线制定步骤是：

(1)在上述引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)两侧的基因组序列上，设计一对新的克隆引物pSV1U和pSV1D，其扩增片段长度为371bp，涵盖了荧光定量引物扩增片段(69bp)的全部，该对克隆引物的引物序列如下：

pSV1U：5’-ATCGCCAACGGTGACGA-3’(SEQ ID NO:4)；

pSV1D：5’-TGCTGGTACTCGTGACTC-3’(SEQ ID NO:5)，

(2)以塞尼卡谷病毒阳性样品RNA(即命名为CH-01-2015株(KT321458)的病毒病料)为模板，利用(1)中所得引物，进行一步法RT-PCR扩增，获得用于构建标准质粒的目的DNA片段；其中50μL反应体系为：PrimeScript 1Step Enzyme Mix：2μL，2×One StepBuffer：25μL，SEQ ID NO:4(10μM)：2μL，SEQ ID NO:5(10μM)：2μL，模板RNA：1μL，无核酸酶蒸馏水：补足至50μL。反应程序为：50℃，30min；94℃，2min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)30个循环；72℃，10min；4℃降温；