[发明专利]塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法

权利要求书

1.一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所示引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所示探针核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针序列3’端的标记基团包括MGB基团。

4.一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所示方法包括以下步骤：

(1)制定塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线；

(2)提取样品中的病毒RNA，-20℃～-80℃冷冻保存备用；

(3)将(2)中的样品病毒RNA进行逆转录，所得逆转录cDNA产物-20℃～-80℃冷冻保存备用；

(4)将(3)所得的样本cDNA产物作为模板进行TaqMan-MGB荧光定量PCR反应；

(5)结合步骤(1)中的标准曲线，判读检测结果。

5.根据权利要求4所述的塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线制定步骤包括：

(1)设计一对RT-PCR引物，序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；

(2)以塞尼卡谷病毒阳性样品RNA为模板，利用(1)中所得引物，进行一步法RT-PCR扩增，获得用于构建标准质粒的目的DNA片段；

(3)将(2)中所得DNA片段与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态，挑取阳性克隆，进行测序鉴定后将重组菌扩大培养并抽提重组质粒；将提取的重组质粒按10¹⁰～10¹拷贝数/μL的浓度梯度稀释成标准质粒样品，分装成小管后-20℃～-80℃冷冻保存备用；

(4)将(3)所得的样本标准质粒作为模板，各浓度梯度样品分别进行TaqMan-MGB荧光定量PCR反应；

(5)根据步骤(4)的反应结果绘制塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线。

6.根据权利要求4所述的塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，

逆转录体系为：5×Primer RT Master Mix:2μL，样品RNA:1～4μL，RNase Free dH₂O:补足至10μL；

逆转录程序为：37℃，15min；85℃，5s；4℃或16℃降温。

7.根据权利要求4所述的塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的TaqMan-MGB荧光定量PCR反应中，反应体系为：

反应程序为：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，34s)40个循环。

8.根据权利要求5所述的塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线制定方法，其特征在于，所述的TaqMan-MGB荧光定量PCR反应中，反应体系为：

反应程序为：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，34s)40个循环。