[发明专利]一种基于适配体修饰磁珠和金纳米颗粒模拟酶活性检测卡那霉素的比色分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于适配体修饰磁珠和金纳米颗粒模拟酶活性检测卡那霉素的比色分析方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

卡那霉素是一种广谱型氨基糖苷类抗生素，分子式C₁₈H₃₈N₄O₁₅S，分子量582.58。卡那霉素主要由灰色链霉菌或小单胞菌发酵液中提取或以天然品为原料半合成提取。卡那霉素硫酸盐作为一种水溶性的抗生素，对许多革兰氏阴性细菌包括沙门氏菌、肺结核杆菌和某些革兰氏阳性菌有疗效，因其价格低廉，用药方便，抗菌谱广，被广泛用作人畜共用药，效果优良。在农业，畜牧业，水产业中卡那霉素不仅可以治疗各种感染类疾病，同时还可以促进畜禽生长，提高经济效益。但是不合理使用卡那霉素会导致动物源性食品中卡那霉素的残留，通过生物循环系统进入人体，引起人体不同程度的损害，伴随而来的是对公众健康和环境的潜在危害。各国政府机构根据其经济发展水平对动物源性食品中抗生素残留的最大允许残留限量（MRL）做了明确规定，目前我国规定牛乳中卡那霉素的MRL≤200 μg•kg^-1。

传统的卡那霉素残留检测方法有微生物检测法和仪器检测法，后者包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、液-质联用法（HPLC-MS）、液相色谱-串极质谱法（HPLC-MS/MS）、紫外分光光度计法（UV）、酶联免疫分析法（ELISA）等。微生物检测法应用较为广泛，其优点是费用低，一般实验室都能操作，但测定时间长，结果误差较大，操作复杂，不能适应特异性、定量检测的需求。仪器检验方法是利用卡那霉素结构和理化性质来进行分离和定性定量测定，其准确性好，但往往设备昂贵，对实验人员也有较高的要求，对样品的预处理要求较高，分析费时而不易推广。因而，建立操作简单便携，特异性好，灵敏度高的卡那霉素检测方法，对加强动物源食品中卡那霉素残留的监控，保障食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是将纳米生物催化、核酸适配体及磁珠捕获等诸多技术的优势联合起来，建立一种简便快速而又具有可视化特征的卡那霉素残留分析方法。

本发明的技术方案，一种基于适配体修饰磁珠和金纳米颗粒模拟酶活性检测卡那霉素的比色分析方法，在该方法体系中，设计了生物素（biotin）修饰的卡那霉素适配体序列和能够与其一端互补的捕获探针cDNA序列。捕获探针的作用有两个：一是能够与卡那霉素适配体序列通过碱基互补作用进行结合；二是通过5’端修饰的巯基（-SH）与金纳米颗粒结合，实现对金纳米颗粒的捕获。具体原理如下，将巯基修饰的捕获探针（cDNA-SH）经过预处理后，与金纳米溶液混合孵育。因为金能够与巯基形成牢固的Au-S共价键，因此，孵育形成了AuNPs-cDNA结构。与此同时，将链霉亲和素(SA)修饰的磁珠（MBs）与生物素化的卡那霉素适配体序列孵育，形成MBs-aptamer结构。AuNPs-cDNA与MBs-aptamer通过cDNA与适配体序列的碱基互补作用而结合在一起，形成MBs-aptamer-cDNA-AuNPs复合结构，从而实现了磁珠对金纳米颗粒的捕获。当有目标物卡那霉素存在时，卡那霉素适配体序列会优先与卡那霉素结合，而使得适配体与cDNA的互补杂交破坏，经过磁性分离后，金纳米颗粒被分离置于上清液中，取上清加入相应的反应缓冲液和底物TMB及H₂O₂，在金纳米颗粒催化下发生反应，溶液颜色为蓝色，最后用浓硫酸终止反应后溶液呈现黄色。当不存在目标物卡那霉素时，复合结构MBs-aptamer-cDNA-AuNPs仍然保持现有的状态，磁性分离后，金纳米颗粒被保留在磁性沉积物中，即上清中不存在金纳米颗粒，加入相应的反应缓冲液和反应底物及浓硫酸终止后，反应体系不发生变色。将反应体系在分光光度计上测定出450 nm处的吸光度数据对卡那霉素进行定量分析。具体原理如图1所示。