[发明专利]猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法。

背景技术

猪伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科水泡病毒属猪疱疹病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病。该病在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。

目前尚无治疗猪伪狂犬病的有效药物，因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。目前在市场上广泛使用是自然缺失弱毒疫苗。自然缺失弱毒疫苗是通过非猪源细胞或鸡胚的连续传代，或在某些诱变剂的存在下，用低于或高于通常的培养温度在细胞培养物上连续传代获得，其基因组的内部存在着多处的点突变以及一些基因的缺失，它是一种自然的基因缺失疫苗。其中，世界上使用最广泛的疫苗主要是PRV Bartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状表明使用的PRV Bartha-K61株疫苗免疫猪产生的中和抗体不能有效中和新分离的病毒PRV HeN1株，该疫苗不能完全保护新流行PRV的攻击。

伪狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技术在PRV基因组中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因(特别是一些毒力基因)不能表达，从而使PRV的毒力减弱，同时又保持其较强的免疫原性。伪狂犬病糖蛋白基因gE是造成伪狂犬病毒潜伏和免疫逃避的主要因素，是伪狂犬病毒的主要毒力相关基因。糖蛋白gE是至今发现的所有PRV毒株(某些疫苗株除外)均能表达的蛋白，具有群特异性，在PRV的鉴别诊断中具有重要的意义。因此，通过接种伪狂犬病毒gE基因缺失灭活疫苗来预防和控制狂犬病，已成为国际上普遍接受和流行的方法。

目前对猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗的研究主要是针对如何构建和筛选伪狂犬病病毒基因缺失的毒株，而对相应毒株的培养条件并没有进行深入的研究，大部分是采用常规的培养条件，如公开号为CN 1244692 C的中国专利申请“一种伪狂犬病TK^-/gE^-/gI^-基因缺失标志活疫苗及制备方法”，将构建的基因缺失伪狂犬病病毒株采用原代鸡胚成纤维细胞进行转瓶培养，所用的细胞维持液为含有2％新生牛血清的DMEM溶液，制得的病毒液中病毒滴度仅为10^6.3TCID₅₀/mL，且病毒液的收获所需的时间长。同时由于其细胞维持液含有新生牛血清，会造成血清残留，引发过敏，给疫苗的使用带来一定的安全隐患。因此，亟待对目前的猪伪狂犬病毒gE基因缺失灭活疫苗的生产和收获方法进行改进。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法。

本发明提供的技术方案为如下：

一种用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：

(1)将种子细胞BHK21进行复苏，然后接入转瓶中，加入细胞生长液，置于转瓶机上培养，培养条件为：转速15～20r/min、pH值7.2～7.4、温度36.5～37.5℃；

(2)待步骤(1)中转瓶培养的BHK21细胞长成片后接入猪伪狂犬gE基因缺失病毒，接入毒种的感染复数为0.01，在转速为15～20r/min，pH值为7.2～7.4、温度为35.5～36.5℃的培养条件下培养12h，使病毒与细胞充分接触吸附，然后将转速设为5～10r/min，连续培养 4～6天，待细胞病变CPE达90％以上，收获细胞毒液；

(3)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，制成成品，即得。

其中，上述的将种子细胞BHK21进行复苏具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO₂下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为2～4×10⁵个/mL的细胞悬液。

进一步地，所述的细胞生长液为含有4～8mmol/L谷氨酰胺、0.4～1.2mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱、2～6％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液。