[发明专利]一种二肽基肽酶-4抑制肽及其制备方法与其应用

权利要求书

1.二肽基肽酶-4的抑制肽在制备防治糖尿病药物中的应用，所述的抑制肽的氨基酸序列为：Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly- Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，二肽基肽酶-4抑制肽的制备方法包括以下步骤：

（1）杂色蛤酶解物的制备：

将杂色蛤软体洗净泥沙，加入3至8倍量水煎煮1至3次，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加3至8倍量水匀浆后，加入酶酶解，酶的加入重量为肉渣重量的0.01%-2.0%，酶解的温度为37至50 ℃，酶解的pH为 7至9，酶解反应时间为2至6 h；酶解结束后, 于沸水浴灭活，然后加入无水乙醇进行醇沉，静置，再取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉；

（2）离子交换色谱纯化：

取步骤（1）酶解得到的冻干粉，用去离子水溶解后，经离子交换色谱分离，流动相：A相为水，B相为0.8 mol/L的氯化钠溶液，梯度洗脱，流速：2 mL/min；检测波长：220 nm；经过离子交换色谱分离得到不同组分的酶解物，分别测定各组分对二肽基肽酶-4的抑制活性，取活性最好的部分，冷冻干燥，得冻干粉；

（3）反向色谱分离纯化：

取步骤（2）分离后的冻干粉以甲醇溶解，经过反相高效液相色谱分离，流动相：A相为体积浓度0.1%甲酸；B相为甲醇，梯度洗脱；流速：10mL/min；柱温：30 ℃，检测波长为220nm，分离收集得到二肽基肽酶-4的抑制肽，该抑制肽氨基酸序列为Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly-Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp；

步骤（1）所述的酶为中性蛋白酶，所述中性蛋白酶活性为10000至50000U/g；

步骤（1）酶的加入重量为肉渣重量的0.01%-2.0%，酶解的温度为37至50 ℃，酶解的pH为 7至9，酶解反应时间为2至6 h；

步骤（2）梯度洗脱条件为：0～40min 内0.8 mol/L氯化钠溶液体积比为0%，40～140min内 0.8mol/L氯化钠溶液体积比为0%～100%；

步骤（3）梯度洗脱程序为：0~10min，B相甲醇体积比例由2％至10％，10~20min，B相甲醇体积比例由20％至40％，20~25min B相甲醇体积由40％至100％。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）生物酶的加入重量为肉渣重量的2%，酶解的温度为45 ℃，酶解的pH为7.5，酶解反应时间为4 h。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）将杂色蛤软体洗净泥沙，加入3至8倍重量的水煎煮1至3次，每次30分钟至120分钟，分离煎煮液与肉渣，沥干。