[发明专利]一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于荧光定量PCR领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒。

背景技术

WHO数据显示，病毒性肝炎一直位列全球排名前七的死亡原因，每年多达145万人因此丧生。全球乙肝病毒慢性感染者高达近2.4亿人，我国是乙型肝炎病毒（HBV）高度易感人群，约有1.2亿HBsAg携带者，该病毒严重地危害着我国人民健康。2015年全国法定报告传染病发病死亡统计表显示，乙型肝炎的发病数达934215例，死亡数达352人，均占病毒性肝炎首位。

长期服用核苷（酸）类药物易产生耐药，主要核苷（酸）类药物的服用时间及其耐药发生率见表1。在用药过程中，患者体内HBV DNA及谷丙转氨酶（ALT）逐渐下降，继而达到一个平稳期，患者病情减轻。此时，HBV很难被完全清除，而是处于一个低复制非活动时期。随着用药时间的延长，对药物敏感的野生株数量下降，具有耐药突变的变异株因对药物不敏感，而得以不断复制、增加，从而导致HBV DNA及ALT重新上升，使得肝炎复发。

现阶段，临床上检测乙肝耐药基因突变主要采取测序法和基因芯片法进行检测。测序法仅能测出突变比例≥20%的样本，且整个检测周期需要7天，操作复杂不适合临床推广；基因芯片法灵敏度仅能达到10⁴copies/mL，且操作过程容易造成交叉污染导致假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，主要采取多重实时荧光PCR法对乙肝耐药基因突变进行检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明在一个试剂盒内包含乙型肝炎病毒P区的11种耐药基因突变检测（rt80、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250），通过8个反应缓冲液进行扩增，每个反应缓冲液包含两个或者三个荧光通道，通过耐药基因扩增Ct值与外控Ct值之间的差异（ΔCt值）来判断是否发生耐药突变。

所述试剂盒包括如下：

反应液1#包含rt80特异性引物及探针、rt180特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液2#包含rt169特异性引物及探针、rt204特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液3#包含rt181特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液4#包含rt194特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液5#包含rt202特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液6#包含rt184特异性引物及探针、rt250特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液7#包含rt173特异性引物及探针、rt236特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液8#包含外控特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

酶混合液包含热启动Taq酶及UNG酶；

阳性对照包含特异性质粒及TE水；

阴性对照包含TE水。

引物探针序列：

试剂组分配方：

反应液1#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl₂ 2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，rt80上游引物417nmol/L，rt80下游引物417nmol/L，rt80探针62.5nmol/L，rt180上游引物417nmol/L，rt180下游引物417nmol/L，rt180探针62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。