[发明专利]一种病原性副溶血弧菌快速检测试纸

权利要求书

1.一种病原性副溶血弧菌检测试纸，其特征在于，所述的检测试纸包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标兔抗副溶血弧菌抗体的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有依次排列的四条检测线T1、T2、T3、T4和一条质控线C，其中四条检测线T1、T2、T3、T4分别是副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌破碎蛋白；靠近吸水垫的质控线C为羊抗兔IgG；

所述的检测线T1、T2、T3、T4上抗原蛋白的划线浓度分别为外膜蛋白0.8mg/mL、鞭毛蛋白0.3mg/mL、胞外产物1.0mg/mL、全菌破碎蛋白0.4mg/mL。

2.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的兔抗副溶血弧菌抗体的制备方法如下：

将副溶血弧菌扩大培养，并将病原菌浓度调至1×10⁸CFU/mL，福尔马林灭活后，分4次免疫纯种新西兰大白兔；第一次混入弗氏完全佐剂，背部皮下注射免疫，间隔一周后加强免疫，将副溶血弧菌与弗氏不完全佐剂混匀，背部皮下注射免疫，间隔两周后重复一次；最后一次于耳缘静脉免疫，一周后取血，分离得到血清，辛酸-硫酸铵法纯化得到兔抗副溶血弧菌抗体。

3.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的副溶血弧菌外膜蛋白，其制备方法如下：

将副溶血弧菌扩大培养，离心后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、重悬至原体积1/25，加入少量10％蔗糖，混匀后-20℃下作用15min；室温下加入等体积0.4％Triton-X100，作用一段时间后离心取上清，加入2.5倍体积冰乙醇-20℃过夜；离心取沉淀，洗涤重悬后，加入等体积KI溶液，37℃作用1h；离心取上清，加入2.5倍体积冰乙醇-20℃过夜；离心取沉淀，重悬后透析、冻干得到副溶血弧菌外膜蛋白。

4.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的副溶血弧菌鞭毛蛋白，其制备方法如下：

将副溶血弧菌扩大培养，离心后PBS洗涤、重悬至原体积1/20，用1mol/L HCl调整pH＝2.0，搅拌30min；低温离心取上清，然后低温超高速离心再取上清；用1mol/L NaOH调整pH中性，加入(NH₃)₂SO₄，4℃放置过夜；低温超高速离心，取沉淀，重悬后透析、冻干得到副溶血弧菌鞭毛蛋白。

5.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的副溶血弧菌胞外产物，其制备方法如下：

将副溶血弧菌接种于液体培养基中培养24h，取液体培养物涂布于预先放置了一层玻璃纸的固体琼脂平板上，37℃培养36h；每平板用少量PBS洗下菌体，收集后4℃下高速离心；上清液经微孔滤膜过滤，加入(NH₄)₂SO₄，4℃放置过夜；低温离心取沉淀，重悬后透析、冻干得到副溶血弧菌胞外产物。

6.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的副溶血弧菌全菌破碎液，其制备方法如下：

将副溶血弧菌扩大培养，将菌液置于超声波破碎仪中低温破碎10min，所得即为全菌破碎液，冻干得到副溶血弧菌全菌破碎蛋白。

7.权利要求1所述的检测试纸在检测副溶血弧菌中的应用。

8.一种检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，所述的方法，是使用权利要求1所述的检测试纸进行检测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法的判定标准如下：

Ⅰ：C线呈现红色条带，T1、T2、T3、T4线皆不显色，结果为副溶血弧菌阳性；

Ⅱ：C线及T1、T2、T3、T4线皆出现红色条带，结果为副溶血弧菌阴性，或者该菌浓度低于检测限；

Ⅲ：C线及T4检测线显色，T1、T2、T3线出现1条或多条线不显色，结果为副溶血弧菌阴性，但感染了与副溶血弧菌抗原存在交叉反应的其他病原菌，结果判定为其他菌的交叉反应。