[发明专利]一株过表达糖基转移酶基因的工程菌及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及微生物发酵，尤其是涉及一株过表达糖基转移酶基因的工程菌及构建方法。

背景技术

糖基转移酶(glycosyltransferases,Gtfs)是一系列参与催化双糖、聚糖和糖复合物中糖链合成的一类酶，主要负责将活性供体的单糖转移到糖、蛋白质、脂质以及核酸分子上，完成糖基化反应。已有研究表明糖基转移酶基因(epsB)是多糖生物合成过程中的重要基因，作用是参与多糖重复单元的聚合并决定多糖的链长(J Bacteriol,2003,185(20):6057-6066；Microbiology-Uk,1997,143:2395-2405)。

微生物絮凝剂(Microbial flocculant,MBF)是微生物分泌的能够使悬浮液中的固体颗粒、菌体、细胞和胶状物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白质、纤维素和DNA等。微生物絮凝剂具有安全、高效、可生物降解和对环境无污染等优势，且能产生絮凝剂的微生物种类多、生长快、易于采用工程手段而实现产业化。因此微生物絮凝剂的开发前景十分看好。目前，多糖生物絮凝剂已经应用于去除纺织印染废水中的色素(Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.)，还可以去除工业废水中的重金属离子和其它悬浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)。然而多糖絮凝剂产量低、成本较高，制约着它的大规模工业化应用。目前，对于培养基、培养条件、生长因子等外部因素影响多糖絮凝剂合成的报道已经很多(Process Biochemistry,2014,49(4:576-582；Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,116:257-264)。而从地衣芽孢杆菌的遗传及生理学角度对其多糖絮凝剂合成量影响的报道甚是少见。由于多糖絮凝剂结构复杂，且大多数针对多糖的研究并不关注絮凝活性，所以有关多糖絮凝剂代谢途径的研究还较少，而通过分子生物学技术改造菌株提高多糖絮凝剂产量的报道几乎没有。因此通过基因工程技术构建高产优良菌株，进一步提高多糖絮凝剂活性及产量，具有重要的经济价值及社会意义。

本申请人在中国专利200910111262.4提供了地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该微生物已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。

发明内容

本发明的第一目的在于要解决的技术问题是针对现有技术中多糖絮凝剂絮凝活性不高、调控机理不明等问题，提供糖基转移酶基因epsB。

本发明的第二目的在于提供一株过表达糖基转移酶基因的工程菌及构建方法。

本发明的第三目的在于提供过表达糖基转移酶基因的工程菌在制备多糖絮凝剂中的应用。

所述糖基转移酶基因epsB利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，所述糖基转移酶基因epsB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

所述过表达糖基转移酶基因的工程菌是将糖基转移酶基因epsB片段连接到表达载体上，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中，通过抗性筛选获得过表达糖基转移酶基因的工程菌。所述表达载体为游离载体，优选表达载体为PHY300PLK-PamyL-TTamyL。所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。

所述过表达糖基转移酶基因的工程菌的构建方法包括以下步骤：

1)设计PCR引物扩增糖基转移酶基因epsB；

2)将扩增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位点，得到PHY300-epsB过表达质粒；

3)然后将PHY300-epsB过表达质粒导入到E.coli DH5α中，以备扩增后电转化；

4)将经提取、浓缩后的PHY300-epsB过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子；