[发明专利]基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法

权利要求书

1.一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

（1）、在无菌条件下，使用20ml的注射器，将1ml肝素钠生理盐水抽吸入注射器内，然后继续使用注射器抽入骨髓9ml，去掉针头后，将肝素钠生理盐水和骨髓加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混合均匀后，得到骨髓悬液；

（2）、在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封；

（3）、将患者的外周血分装于50ml离心管中，每管45ml,在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；

（4）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，离心20min，然后吸取中间白膜层，然后向白膜层内加入50ml PBS，并吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；

（5）、向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，然后取15ml 含自体血清和硫酸庆大霉素的DMEM高糖培养基加入到目的细胞内，然后将细胞吹打均匀，并计数，以5×10⁵/ cm²接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的CO₂培养箱中培养，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基也含10%自体血清和40U/ml硫酸庆大霉素；

（6）、 细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；

（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶- EDTA 溶液，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于37℃，5%的CO₂温箱2-3min后，倒置在显微镜下，观察到细胞回缩、细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入5ml高糖DMEM培养基终止消化；

（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞从瓶壁上脱落，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖DMEM培养基，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；

（9）、向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，然后取含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖DMEM培养基调节细胞浓度为1×10⁸/L，将细胞接种于75cm²细胞培养瓶内继续培养；

（10）、细胞培养3-4周后，细胞传代3次；

（11）、 吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶- EDTA 溶液，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；

（12）、将细胞悬液离心7min，弃上清，再用PBS洗涤细胞3次；

（13）、细胞计数，向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×10⁶/ml；

（14）、向DMEM高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml，取一个无菌猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜，糙面朝上，光面朝下放置于无菌塑料培养皿中，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖DMEM培养基浸泡过夜；

（15）、将步骤（13）制备得到的细胞悬液滴入准备好的猪源Ⅰ/Ⅲ型胶原膜上，细胞数约1×10⁶/cm²，继续培养3天，即可。