[发明专利]利用报告基因选择性富集突变核酸片段及其方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及基因工程和基因分析，具体涉及一种利用报告基因选择性富集突变核酸片段的方法。

背景技术

肿瘤是一种病因尚未完全阐明的疾病，主要有基因突变所导致。因此，筛选肿瘤高危人群以及进行早期诊断和治疗尤为重要。近年来，随着免疫学，生物化学，分子生物学及相应技术的发展，肿瘤生物学标志物的研究也得到了深化和突破，尤其是肿瘤循环DNA的发现，为肿瘤早期诊断的无创性和敏感性带来了契机。并使循环DNA成为肿瘤早期诊断研究的新靶点。

自杀基因(suicide gene)，是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死，此类基因称为自杀基因。自杀基因若能正常表达，其携带的基因表达的蛋白质便能杀死宿主细胞，若自杀基因那段序列不能正常编码即移码或含有终止密码子，便不能正常表达自杀基因，宿主细胞便能正常生长。利用热点突变如KRAS12位点突变，突变之后含有终止密码子，将这段序列克隆到自杀基因中，看他在自杀基因上的生长情况。若突变前，不含有终止密码子，便不能正常在宿主细胞上生长；突变后，含有终止密码子，能在宿主细胞上生长。自杀基因具有敏感性高，假阳性等优点，从而用于检测循环DNA。循环DNA是存在于外周血中的有利于细胞外的核酸。目前检测循环DNA的方法有Sanger一代测序和高通量测序及数字PCR等，Sanger一代测序敏感性不到百分之十，高通量测序及数字PCR等敏感性最大可达到千分之一，但可能存在假阳性且现有千分之一的敏感性仍不足以对肿瘤进行早期诊断。

发明内容

本发明所要解决的问题在于提供一种利用自杀报告基因选择性富集突变核酸片段及其方法，通过选择性破坏抑制含有一种特定基因型片段相关载体的扩增而不会抑制另外基因型片断相关载体的扩增，达到将特定基因型片段进行富集的目的。

本发明的第一方面提供的技术方案：以自杀基因作为报告基因选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，以选择性抑制核酸样本中含等位基因的野生型基因片段的扩增，而不抑制核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的扩增。从而为测序提供一种已经对突变基因进行了富集的待测标本，以提高测序分析的敏感性。

本发明优选的技术方案中，以含有自杀基因的质粒载体选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，优选以含自杀基因pDONER211质粒载体选择性富集核酸样本中的突变核酸片段。且自杀基因的序列为Seq ID No.1所示。

本发明优选的技术方案中，所述核酸样本中含等位基因的野生型基因片段不含有终止密码子，而突变型基因片段含有终止密码突变或含有可转化为终止密码子的突变，即突变型基因片段在克隆进自杀载体后始终表现出含有终止密码子的作用而使自杀基因丧失自杀作用。

本发明优选的技术方案中，核酸样本中含等位基因的野生型基因片段或突变型基因片段为10-200bp；更优选地，所述野生型基因片段或突变型基因片段为20-100bp；进一步，所述野生型基因片段或突变型基因片段优选为10-50bp。

本发明优选的技术方案中，所述核酸样本中含等位基因的突变型基因片段为点突变或移码突变。

优选地，核酸样本中含等位基因的野生型基因片段为10-200bp，且不含终止密码子；更优选地，所述野生型基因片段为20-100bp，且不含终止密码子；进一步所述野生型基因片段优选为10-50bp，且不含终止密码子。

本发明的第二方面提供自杀基因作为报告基因进行选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)评估核酸样本情况，

(2)提供含有自杀基因作为报告基因的质粒载体，

(3)将步骤(1)中的核酸样本连接到步骤(2)中的含有自杀基因作为报告基因的质粒载体中，

(4)将步骤(3)中的质粒载体转化H5a感受态细胞，在含有抗性筛选的琼脂培养基上培养富集，

(5)挑取筛选培养基上的菌落，测序验证。

本发明优选的技术方案中，所述步骤(1)中核酸样本中含等位基因的野生型基因片段或突变型基因片段为10-200bp，且不含终止密码子时，评估适于本方法进行后续操作。

本发明优选的技术方案中，所述步骤(2)中为含有自杀基因的质粒载体，所述步骤(3)中将核酸样本连接到含有自杀基因的质粒载体中；优选地为pDONER211质粒载体。