[发明专利]一种适配子结合蛋白的检测方法

说明书

本发明涉及一种可以特异、灵敏地检测适配子结合蛋白的分析方法。该方法通过识别探针去招募结合蛋白，利用DNA双链杂交的方式将光交联基团引入到结合蛋白，并通过光引发将结合蛋白共价键合到捕捉探针上，实现了适配子结合蛋白的高效鉴定。本方法解决了由于适配子与结合蛋白作用力较弱，适配子结合蛋白难以鉴定的问题，适用于丰度较低的、结合力较弱的适配子互作蛋白分析。本发明的探针合成过程简单、选择性好、灵敏度高，可以实现对实际体系中适配子结合蛋白的特异性检测与富集。

技术领域

本发明涉及生物化学和生物医学检测技术领域，尤其是涉及适配子结合蛋白的检测与鉴定，特别是涉及到溶菌酶的检测和鉴定。

背景技术

蛋白质是生命体的重要物质基础，尤其是与疾病相关的生物标志物的鉴定对于疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。基于适配子的“钓鱼”技术在疾病相关的生物标记物的检测中逐渐发展起来。利用适配子作为“诱饵”，在其末端修饰报告基团，如用于生物成像的荧光基团或用于亲和富集的生物素，将修饰有报告基团的适配子与复杂的蛋白体系孵育，找到与适配子特异性结合的蛋白等生物标记物，然后通过报告基团对蛋白进行亲和富集或者荧光标记，最后通过质谱等对蛋白进行定性及定量分析。

适配子(aptamer)是一段人工合成的单链DNA或RNA，可以通过非常成熟的指数级富集配子系统进化(SELEX)技术从特定的寡核苷酸库中筛选出来，对某种特定的靶标具有特异性识别。它具有一定的空间结构，可以特异性地识别蛋白、小分子以及复杂的细胞、组织等。由于适配子具有亲和力强、特异性好、稳定性好、易改造修饰、快速合成等优点，作为生物探针在生命科学、临床诊断、药物发现和环境科学等方面可以部分取代抗体的作用。

传统的适配子为诱饵的蛋白质捕获技术难以捕捉分子间弱的以及暂时的相互作用，并且在复杂的洗脱过程中容易损失蛋白。因此发展出一种光交联技术，在适配子上修饰光交联基团，通过紫外光照引发光交联，使适配子与蛋白质之间的弱作用力转化为强的共价键作用，以解决上述问题。然而，光交联基团对适配子骨架的修饰通常会影响适配子的结构，进而影响适配子对目标蛋白的识别特性。另外，由于化学合成技术的限制，光交联基团只能被修饰到适配子DNA链上有限几种不同的碱基上且合成步骤繁琐，无法灵活地改变光交联基团与目标蛋白之间的相对位置，使得该分析方法具有一定的局限性。

目前也有很多基于适配子检测或识别蛋白质的其他方法出现，例如表面等离子体共振、原子力、电化学发光等等。但在采用适配子检测时，如何控制检测并避免修饰官能团对蛋白质与适配子间识别与互作的干扰，是提高检测方法的灵敏性和特异性需要解决的关键技术。

溶菌酶是一种由多形核白细胞分泌的抗菌蛋白质，又称为N‐乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N‐乙酰胞壁酸和N‐乙酰氨基葡糖之间的β‐1,4糖苷键，导致细胞壁破裂、内容物逸出而使细菌溶解。并且，溶菌酶可以与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。此外，溶菌酶还是多种动物组织的内源性免疫系统的重要组成部分。

该酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的唾液、泪液、气管分泌物等中，而且在不同组织其正常含量也各不相同。溶菌酶在人体液中的浓度在临床上可以作为许多疾病诊断的辅助标志，例如口咽部念珠菌感染的病人唾液中的溶菌酶浓度会升高；肾病患者的尿液中会出现溶菌酶；血液、脑脊髓液中溶菌酶的浓度是白血病和中枢神经系统肿瘤疾病的重要辅助诊断依据；新生儿体内溶菌酶缺乏可能会导致支气管性肺发育障碍等等。因此对于溶菌酶的检测在临床诊断学上具有重要的辅助诊断意义。