[发明专利]一种接头和通过高效率环化方式构建测序文库的方法

说明书

本发明，提供了一种接头和通过高效率环化方式构建测序文库的方法。具体地，本发明提供一种接头，所述接头为正义链和反义链形成的具有互补的突出末端的双链核酸分子；所述双链核酸分子上含有生物素标记。本发明还提供了一种所述接头的制备方法，以及一种使用所述接头通过环化方式构建DNA高通量测序文库的方法。本发明中的接头序列短、合成成本低、制备方法简便且易于与文库片段分离；构建测序文库的方法相比其他长片段文库，环化效率更高，能在测序之前鉴定构建是否成功，并能识别核酸片段错误连接的位置。

技术领域

本发明属于基因组高通量测序技术领域，具体地，本发明涉及一种接头和通过环化方式构建DNA高通量测序文库的方法。

背景技术

全基因组测序对全面了解一个物种的基因组成、代谢通路和分子进化等有着非常重要的意义。近年来，第二代高通量测序技术取得了突飞猛进的发展，使得测序成本逐年下降，但是应用最广的短插入片段文库测序，由于无法跨越重复序列和二级结构等区域，使得基因组组装往往只能得到一些片段而不是基因组全长。第三代测序技术虽然可以获得较长的测序序列，但是成本一直居高不下，目前其推广和应用程度远低于第二代测序。如何改进文库构建和测序方法，更加高效低成本地获得较为完整的基因组序列，成为了高通量测序领域的研究热点。

各大仪器和试剂公司，包括Illumina、Roche、Lucigen等，已能提供适用于第二代测序的长片段文库构建试剂盒，但是这些方法很大程度上局限于核酸片段的大小，对于较大的核酸分子进行环化文库构建的效率较低，并且还存在实验过程复杂，成本和错误率都较高等缺点，使得其实际应用范围较窄。

因此本领域迫切需要一种能够有效提高环化效率和拼接准确度的长片段文库构建方法。

发明内容

本发明的目的在于解决现有的DNA高通量测序建库方法中长片段文库环化效率低和错误率高等问题，提供一种能够有效避免拼接错误的高效的长片段文库构建方法。

为了达到以上目的，本发明提供一种新的接头和通过环化方式构建测序文库的方法，该方法适用于多种测序平台。

在本发明的第一方面，提供了一种接头，所述接头为正义链和反义链形成的具有互补的突出末端的双链核酸分子；其中，所述双链核酸分子上含有生物素标记；

并且所述正义链的序列选自：SEQ ID NO：1；而所述反义链的序列选自下组：SEQID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

在另一优选例中，所述双链核酸分子中正义链的5’末端的核苷酸带有磷酸基团。

在另一优选例中，所述双链核酸分子中反义链上含有生物素标记。

在另一优选例中，所述双链核酸分子中反义链上含有一个被生物素标记的胸腺嘧啶。

在另一优选例中，所述双链核酸分子中正义链上含有生物素标记。

在另一优选例中，所述的反义链为SEQ ID NO.:2。

在本发明的第二方面，提供了一种本发明的第一方面所述的接头的制备方法，包括：

(1)分别合成正义链和反义链核酸分子，其中至少一条链上含有生物素标记；和

(2)对所述正义链和反义链核酸分子进行混合后，先变性再退火，形成具有互补的突出末端的双链核酸分子，即本发明的第一方面所述的接头。

在另一优选例中，其中正义链核酸分子的5’末端的核苷酸带有磷酸基团。

在另一优选例中，其中正义链核酸分子上含有生物素标记。

在另一优选例中，其中反义链核酸分子上含有生物素标记。

在另一优选例中，所述反义链核酸分子上含有一个生物素标记的胸腺嘧啶。