[发明专利]一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子，其特征在于：其启动子序列如序列表中SEQ IDNO:1所示。

2.权利要求1所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)基因组DNA的获取：取1.0g紫花苜蓿新鲜叶片，利用QIAGEN公司的DNeasy PlantMaxi Kit提取总DNA，所得的DNA量≥30μg；

(2)特异性引物的设计：根据已知的紫花苜蓿HPPD基因编码区DNA序列，设计三个特异性引物SP1：5'-GTGTTTGTCTTGGTGTTGTTGTTA-3'、SP2：5'-AGAGTAATGGAGCGACGG-CGTAGTTG-3'、SP3：5'-GTTCGGGCTCGATCAAACGACTACTG-3'；

Tm值60-70℃；

所述引物SP1、SP2和SP3如序列表中SEQ ID NO:2-4所示；

(3)1st PCR反应：基因组DNA经OD测定，浓度为50ng/μl，取2μl作为模板，以TAKARAgenome walking试剂盒AP Primer四种中的任意一种，作为上游引物，SP1 Primer为下游引物，进行1st PCR反应；

A.按表1中的组份配制1st PCR反应液：

表1

试剂	使用量
紫花苜蓿基因组DNA，50ng/μL	2μL
dNTP Mixture，2.5mM each	8μl
2+plus]]>	5μl
TaKaRa LA Taq，5U/μl	0.5μl
AP1 Primer，100pmol/μl	1μl
SP Primer，10pmol/μl	1μl
2O]]>	32.5μl

B.1st PCR反应条件及步骤如表2所示：

表2

(4)2nd PCR反应：取1μl 1st PCR反应液作为2nd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP2 Primer为下游引物，进行2nd PCR反应；

A.按表3中的组份配制2nd PCR反应液：

表3

试剂	使用量
1st PCR反应液	1μL
dNTP Mixture，2.5mM each	8μl
2+plus]]>	5μl
TaKaRa LA Taq，5U/μl	0.5μl
AP1 Primer，100pmol/μl	1μl
SP2 Primer，10pmol/μl	1μl
2O]]>	33.5μl
总体积	50μl

B.2nd PCR反应条件及步骤如表4所示：

表4

(5)3rd PCR反应：取1μl 2nd PCR反应液作为3rd PCR反应的模板，以AP Primer为上游引物，SP3 Primer为下游引物，进行3rd PCR反应；

A.按表5中的组份配制3rd PCR反应液：

表5

试剂	使用量
2nd PCR反应液	1μL
dNTP Mixture，2.5mM each	8μl
2+plus]]>	5μl
TaKaRa LA Taq，5U/μl	0.5μl
AP1 Primer，100pmol/μl	1μl
SP3 Primer，10pmol/μl	1μl
2O]]>	33.5μl
总体积	50μl

B.3rd PCR反应条件及步骤如表6所示：

表6

(6)取1st、2nd、3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳；

(7)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3 Primer为引物对PCR产物进行DNA测序；将测序获得的序列进行拼接，去除重叠序列，最终获得紫花苜蓿HPPD基因的启动子序列；

所述SP3 Primer如序列表中SEQ ID NO:4所示。

3.权利要求1所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子在调控基因的逆境反应中的应用，其特征在于：

所述逆境反应包括SA、干旱、盐、脱落酸或者先暗处理再恢复光照。