[发明专利]一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法。

背景技术

关节软骨是一种由软骨细胞、软骨基质和II型胶原组成的透明软骨，关节的创伤和炎症均可引起关节软骨的损伤。由于关节软骨再生能力有限，如果人软骨先天缺损或者后天损伤或缺损时，通常不会再生，难以自行修复。关节软骨的损伤会导致患者的关节反复疼痛和活动受限，严重影响了患者的日常生活。作为治疗人软骨疾病的现有方法，有从自身的其他部位采集软骨组织移植到缺损部位的方法，但存在采集部位和数量有限的问题。因此，关节软骨的损伤修复一直是骨科研究的重要课题之一。

软骨组织工程技术是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并且以较高浓度将其种植于具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上构建组织工程软骨，然后植入到组织缺损部位，完成组织的修复和重建。软骨组织工程的最终目的就是得到高质量的修复组织和长期有效的功能，为病人最终解决痛苦。从这种意义上看，组织工程方法是目前治疗关节软骨损伤最有希望的方法，是目前软骨损伤修复研究的主要方面。

近年来，研究者致力于应用组织工程学治疗修复关节软骨损伤的研究，但其前提条件是获取足够数量的软骨细胞，即关节软骨细胞的体外培养及扩增问题。使用软骨细胞移植的方法存在三个问题，即：侵袭采集部位的问题、细胞数量及增殖的问题与维持形态时间的问题。针对第一个问题，侵袭采集部位的问题，是指采集用于培养软骨的软骨时，导致该部位缺损、凹陷等畸形或功能障碍，现有常用解决方案是采集肋软骨组织用于后续细胞分离培养。针对第三个问题，长期维持形态的问题，是指由培养的软骨再生的组织长期未被吸收，是否可以持续维持其形态的问题，这取决于第二个问题的解决。目前的研究者或医务人员认为，如果能获得足够量的软骨细胞，就能够解决第三个问题或者至少能够缓解患者疼痛，因为软骨的缺损导致骨与骨之间相互碰撞摩擦从而刺激或损伤神经，产生剧烈疼痛，但是在骨与骨之间存在足够量的细胞就会显著缓解上述问题。因此，需要提供一种可显著促进软骨细胞增殖的培养基及其方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法。该增殖培养基可显著促进软骨细胞增殖；该培养方法细胞获得周期短、数量较多，获得细胞的活率也较高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种软骨细胞的增殖培养基，包括L-谷氨酰胺、胎牛血清、脯氨酸、非必须氨基酸、鸡胚提取物、青霉素、链霉素和高糖DMEM液体培养基。

作为优选，增殖培养基中各组分用量为：

在本发明提供的实施例中，增殖培养基中各组分用量为：

作为优选，增殖培养基的pH值为7.2～7.4。

作为优选，非必须氨基酸为甘氨酸(Glycine)、L-丙氨酸(L-Alanine)、L-天门冬酰胺(L-Asparagine)、L-天冬氨酸(L-Aspartic acid)、L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)、L-脯氨酸(L-Proline)或L-丝氨酸(L-Serine)中的一种或几种。

在本发明提供的实施例中，非必须氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-丝氨酸的混合物。

在本发明提供的实施例中，甘氨酸的浓度为0.01mM，L-丙氨酸的浓度为0.01mM，L-天门冬酰胺的浓度为0.01mM，L-天冬氨酸的浓度为0.01mM，L-谷氨酸的浓度为0.01mM，L-脯氨酸的浓度为0.01mM，L-丝氨酸的浓度为0.01mM。

作为优选，鸡胚提取物的制备方法为：去除鸡胚中的鸡眼，然后将去除鸡眼的鸡胚进行匀浆，用等体积的DMEM稀释，在15～30℃、10～100rpm/min条件下摇动1～3h，而后转移至-80～-70℃条件下冻存48h以上，解冻后离心，收集上清液，经过滤除菌，得到鸡胚提取物。

在本发明提供的实施例中，鸡胚提取物的制备方法为：去除鸡胚中的鸡眼，然后将去除鸡眼的鸡胚进行匀浆，用等体积的DMEM稀释，在室温、50rpm/min条件下摇动2h，而后转移至-70℃条件下冻存48h以上，解冻后离心，收集上清液，经过滤除菌，得到鸡胚提取物。

在本发明提供的实施例中，离心为在15000g下离心10min。

在本发明提供的实施例中，在收集上清液与过滤除菌之间还包括离心的步骤。