[发明专利]一种用于免疫沉淀的离心柱及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及分子相互作用研究中应用免疫沉淀及类似方法分离相互作用的分子的方法。

背景技术

随着蛋白质组学研究的兴起，生物大分子间的相互作用越来越引起研究者的兴趣。其中包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用，和蛋白质-调控RNA的相互作用等。在此背景下，实验方法和研究手段成为实验成功的重要因素。免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）技术及其衍生方法，就是蛋白质组学研究非常重要的手段。

免疫沉淀技术的是专门研究蛋白质之间或者蛋白质与遗传物质之间相互作用的方法，其凭借特异性强、灵敏度高等优点已逐渐被人们应用于蛋白质与基因的研究领域。免疫沉淀技术基于抗原-抗体的特异性反应，从未知样品或者细胞裂解液中寻找特异性的目标蛋白。

目前免疫沉淀技术已经广泛应用在蛋白质蛋白质相互作用研究，蛋白质DNA相互作用研究等。在医学上，用于丙型肝炎患者补体研究【Sshifferli JA Clin Exp Immunol 42:387】,鉴定抗大肠杆菌分子伴侣GroEL抗体研究【Vandenbroeck K Eur J Biochem 251(1/2):181】,鼠疫监测【Yue MX Journal of Chinese endemic prevention 19(6):342】。由于检测试剂盒药品还比较昂贵，限制了免疫沉淀技术的应用。然而免疫沉淀技术提供的新式实验方法和良好实验结果已逐渐被大部分研究者所接受，终有一天随着技术的改进以及试剂价格的降低，免疫沉淀技术会代替以往那些繁杂和粗糙的方法成为研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与遗传物质之间相互作用的最好方法，将会有更广泛的应用。

典型的免疫沉淀实验包括几个实验步骤，1.样本裂解处理，主要是细胞裂解液；2.抗体与细胞裂解液中的目标蛋白结合；3.上述步骤形成的抗原-抗体复合物与ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶孵育，使抗体与ProteinA/G反应，形成ProteinA/G琼脂糖凝胶-抗体-目标抗原复合物；4.将形成的琼脂糖凝胶复合物离心、洗涤后重悬于电泳上样缓冲液；5.在电泳上样缓冲液中加入还原剂，煮沸后电泳检测。

在上述的实验操作中，ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶要经过多次的洗涤、离心。在此过程中由于ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶本身固有的特性，离心并不能将凝胶完全沉于离心管底部，变成非常结实的沉淀。这样在去掉上清的过程中，不可避免的会有ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶会随着上清而损失。由于免疫沉淀用的抗体和ProteinA/G偶联的琼脂糖凝胶都是非常昂贵的试剂。凝胶的损失不但会造成金钱的浪费，更重要的由于抗体以及结合的目标抗原随着凝胶丧失，会影响免疫沉淀实验的结果。

典型的免疫沉淀操作见说明书附图图8

从图上可以看出，典型的免疫沉淀操作包括5-6次的离心操作。由于琼脂糖凝胶固有的特性，每次离心去上清都会有10%-20%的凝胶损失。并且还是由于琼脂糖凝胶的固有特性，去上清并不能去除的很干净，凝胶中还是有部分的上清存在。这样，为了使ProteinA/G琼脂糖凝胶-抗体-抗原复合物背景更干净，很多研究者会增加洗涤的步骤。这样会进一步增加琼脂糖凝胶总量的损失。

为了解决这一问题，研究者通常都会自行想一些解决办法，通常的做法是增加一些普通的琼脂糖凝胶，就是没有偶联ProteinA/G的空白琼脂糖凝胶，混合在ProteinA/G琼脂糖凝胶中一起洗涤，离心。由于空白琼脂糖凝胶价格较低，这样在最后实验完成后，尽管会有50%-60%的总的琼脂糖凝胶损失掉，但是由于在琼脂糖凝胶中混合了空白的琼脂糖凝胶，这样ProteinG/A琼脂糖凝胶-抗体-抗原的总体损失比例会降低。但是这种方法有几个缺点。1.混合空白琼脂糖凝胶的方法并没有彻底解决离心过程中琼脂糖凝胶损失的问题，至少降低了ProteinG/A琼脂糖凝胶的损失比例；2.空白琼脂糖凝胶不能与抗体结合，并不参与免疫沉淀反应，实际上降低了免疫沉淀的效率。