[发明专利]一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法

权利要求书

1.一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括：

S1：构建基础载体

以pUC19载体为骨架，采用森林草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.1所示的pSG01载体；

以pUC19载体为骨架，采用栽培草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.2所示的pSG02载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以双CaMV 35S启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQ IDNO.3所示的pCCF001载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQID NO.4所示的pCCU001载体；

S2：靶序列退火复性：合成互补的Oligo DNA，将合成的Oligo序列进行退火复性获得DNA双链序列，并稀释；

S3：pSG01和/或pSG02质粒的酶切：采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01和/或pSG02载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；

S4：连接和转化：配置连接体系，将S2获得的稀释后的DNA双链序列与S3获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中；

S5：重组质粒的鉴定和提取：分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中振荡培养，分别以M13fwd和序列为SEQ ID NO.6所示的Oligo-R为引物进行菌液PCR鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒，其中，M13fwd的序列为GTAAAACGACGGCCAGT；

S6：重组质粒和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切：将S5得到的重组质粒和S1构建的pCCF001或pCCU001质粒进行双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段；

S7：连接、转化和鉴定：配置连接体系，将S6获得的酶切回收目标片段进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中，挑单菌落于LB/Kan液体培养基中振荡培养，并进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养，提取质粒，即获得构建好的CRISPR/Cas9载体。

2.根据权利要求1所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，合成一对互补的Oligo DNA，即序列为SEQ ID NO.5所示的Oligo-F，序列为SEQ ID NO.6所示的Oligo-R。

3.根据权利要求1所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，合成两对互补的Oligo DNA，即序列为SEQ ID NO.7所示的Oligo1-F、序列为SEQ ID NO.8所示的Oligo1-R、序列为SEQ ID NO.9所示的Oligo2-F、序列为SEQ IDNO.10所示的Oligo2-R。

4.根据权利要求2或3所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，将所述合成的Oligo DNA序列进行退火复性的反应程序为：95℃变性5min，每30s降温1℃，降温至25℃，并于4℃保存。

5.根据权利要求2所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在步骤S3中，采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01或pSG02载体，反应体系100μL，37℃反应过夜，65℃反应20min获得相应的酶切产物。