[发明专利]一种兔支气管败血波氏杆菌单因子血清

说明书

技术领域

本发明属于家畜病毒检测技术领域，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌单因子血清。

背景技术

兔支气管败血波氏杆菌病在秋冬季节和早春多发；该菌主要通过空气传播，经呼吸道而感染。幼兔发病率高，并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在群养兔污染为64.4％，散养兔为20％。在自然条件下，多种哺乳动物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天气突变，兔的抵抗力下降，兔舍卫生不好，空气污浊等情况下，均可引起本病发生。本病的潜伏期7～10d。成年兔表现鼻炎和支气管炎。有多量的浆液性、黏液性鼻液流出。鼻炎长期不愈，鼻腔流出黏液性或脓性分泌物，打喷嚏，呼吸困难，不食，消瘦等。仔兔多呈急性经过，初期刚见鼻炎病状后，即表现呼吸困难，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病变为鼻炎、化脓性鼻气管炎、化脓性支气管肺炎，个别的出现败血病变化。鼻腔、气管黏膜充血、水肿。鼻腔内有浆液性、黏液性或黏液脓性分泌物。在肺门支气管周围到肺的边缘见有支气管肺炎病灶。病变多见于心叶、尖叶，严重的病例，波及全肺叶。病变部隆起、坚硬，呈暗红色，褐色，进而为灰黄色。有些病例肺上有大小不等的脓疮。严重的占肺部的90％以上。有的肝脏表面有黄豆至蚕豆大的脓疮。脓疮破后可见黏稠的奶油状乳白色的脓汁。还见有心包炎、胸膜炎、胸腔积脓及肌肉脓肿等。

根据临床病状及剖检变化可初步确诊。但必须进行细菌学检查，找出病原才能最后确诊。采取呼吸道分泌物或病变组织涂片，革兰氏染色，镜检，能看到革兰氏阴性、小球杆菌；如用美蓝染色，镜检，可见多形态、两极染色的小杆菌。血清学检查可用平板凝集试验，在洁净的玻片上，滴加1滴菌液(2500亿菌1ml)，再加1滴被检血清， 充分混合，在20～25℃条件下作用2～5min，出现颗粒絮状物，液体清亮为阳性。以上检测方法均不能进行对分离到的病原菌直接定性，往往存在同种类分离菌的影响，不能精确确诊，易出现误诊。

发明内容

本发明的目的是提供一种兔支气管败血波氏杆菌单因子血清，所提供的血清可以更灵敏、更特异的检测到兔体是否感染了兔支气管败血波氏杆菌，并且对筛选的菌株具有检测的特异性，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供的兔支气管败血波氏杆菌单因子血清，是从兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株基因组中PCR扩增出抗原蛋白PPP的编码基因，再将该编码基因通过PET32a(+)表达载体构建出能表达兔支气管败血波氏杆菌保护性蛋白PPP的大肠杆菌BL21重组基因工程菌，通过对基因重组工程菌的诱导、超声破碎、融合蛋白纯化、定量，将纯化后的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白与弗氏完全佐剂进行乳化制备出了兔支气管败血波氏杆菌基因工程重组亚单位疫苗；再将此疫苗强化免疫Balb/C小鼠三次，每次间隔14d，免疫结束后用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株进行攻毒，选择攻毒后无发病临床症状的健康小鼠采集血清制备成单因子血清抗体。

所述的兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(Rabbit Bordetella bronchiseptica QDBb01)，于2016年11月01日保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016607。

上述使用的兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原蛋白PPP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

其中编码兔支气管败血波氏杆菌的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明的兔支气管败血波氏杆菌单因子血清用于制备检测兔支气管败血波氏杆菌的制品；

将上述的单因子血清用于检测兔支气管败血波氏杆菌，操作步骤 包括如下：

通过将待检测的样品菌进行3％TSB培养基培养后，先收集细胞于离心管中，1500r/min离心收集细菌，并用PBS重悬洗涤收集菌，然后加入10％多聚甲醛对重悬菌体固定、1％BSA封闭，再依次加入试剂盒中制备的一抗(兔支气管败血波氏杆菌单因子血清)、二抗(FITC标记的山羊抗小鼠IgG)赋育，以上操作步骤均采用1500r/min离心10min的方法进行洗涤多聚甲醛以及未结合的BSA、一抗和二抗，最后将染色后的细菌液滴至载玻片上，并用盖玻片封片，于荧光显微镜下观察。

本发明通过制备兔支气管败血波氏杆菌单因子血清抗体，将待检兔支气管败血波氏杆菌悬浮培养后，采用间接免疫荧光检测技术(IFA)进行该菌悬浮状态下的一抗、二抗荧光抗体染色。该检测方法能够具体检测到兔支气管败血波氏杆菌的单个菌体(出现特异性绿色荧光)，具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点。

附图说明