[发明专利]一种外泌体miRNA精确获取的方法

说明书

技术领域

本发明涉及RNA检测领域，尤其涉及一种外泌体miRNA精确获取的方法。

背景技术

外泌体于1983年首次在绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。外泌体为直径在40-100nm的盘状囊泡，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

当外泌体被发现后，一度被认为是细胞排泄废物的一种方式，随着对外泌体研究的不断深入，包括对其生物来源、分布、物质构成及运输和细胞间信号传导的研究，发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能根据来源细胞类型的不同，可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究表明来源肿瘤细胞的外泌体参与肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息交换，从而导致大量新生血管生成，促进肿瘤的生长与侵袭。

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中的一类内源性、具有调控功能的非编码RNA。miRNA长约20～25个核苷酸，成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的。miRNAs组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。

目前，针对外泌体miRNA的研究主要是基于外泌体miRNA的总浓度、定量PCR(Q-PCR)以及microRNA芯片技术，更多关注获取到的miRNA的表达和定量，但是在现有技术中，外泌体miRNA获取方法虽然很多，但是精确度和纯度不够，存在很多杂质，从而影响后期检测的灵敏度和准确性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种外泌体miRNA精确获取的方法，以解决现有技术中获取的miRNA精确度和纯度不够，影响后期检测灵敏度和准确性的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种外泌体miRNA精确获取的方法，包括以下步骤：

1)从待分离样品中分离获得外泌体；2)从外泌体中提取总RNA，获得外泌体总RNA；3)在外泌体总RNA上连接特异性唯一标签接头，获得带特异性接头的总RNA；4)以带特异性接头的总RNA为模板进行反转录合成cDNA，获得反转录产物；5)TBE-PAGE电泳回收反转录产物中150～170bp的cDNA片段，即得到miRNA；所述特异性唯一标签接头为miRNA常规接头添加8个随机碱基N和3个固定碱基CGA。

优选的，所述的随机碱基N为A、T/U、C和G中的一种。

优选的，步骤1)中所述待分离样品为外周血或体液。

优选的，所述待分离样品为获取后4～6h内的新鲜样品。

优选的，步骤1)中所述分离获得外泌体的方法为磷脂酰丝氨酸亲和法。

优选的，4)中所述的反转录合成cDNA的温度为41～43℃，时间为50～70min。

优选的，所述反转录完成后，还包括RNA消化步骤，所述的RNA消化步骤为向反转录产物中加入RNaseH混合均匀进行孵育充分消化剩余RNA。

优选的，所述孵育的温度为35～38℃。

优选的，所述孵育的时间为25～35min。

优选的，步骤4)中所述miRNA置于-80℃～-20℃保存。

本发明的有益效果：本发明提供的方法在总RNA上连接特异性唯一标签接头，对每个原始模板进行区分，不仅避免了扩增时分子间存在的偏好性，而且有效实现单个模板的精确计数，可以精确检测低于10个拷贝以下的miRNA分子，从而可以更全面精准的检测所有miRNA的真实表达量以及表达谱。

附图说明

图1为实施例中本发明方法的流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种外泌体miRNA精确获取的方法，包括以下步骤：

1)从待分离样品中分离获得外泌体；2)从外泌体中提取总RNA，获得外泌体总RNA；3)在外泌体总RNA上连接特异性唯一标签接头，获得带特异性接头的总RNA；4)以带特异性接头的总RNA为模板进行反转录合成cDNA，获得反转录产物；5)TBE-PAGE电泳回收反转录产物中150～170bp的cDNA片段，即得到miRNA；所述特异性唯一标签接头为miRNA常规接头添加8个随机碱基N和3个固定碱基CGA。