[发明专利]抗P选择素单链抗体靶向抑制物融合蛋白ScFv‑SPLUNC1及其表达方法与应用

权利要求书

1.抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1，是通过连接肽在抗P选择素单链抗体(ScFv)的羧基端(C端)连接短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)得到的，命名为ScFv-SPLUNC1。

2.根据权利要求1所述的抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1，其特征在于：连接肽为(Gly₄Ser)₂，所述融合蛋白ScFv-SPLUNC1是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗炎作用的蛋白质。

3.编码权利要求1或2所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的基因。

4.根据权利要求3所述编码抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的基因，其特征在于：编码抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗炎作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5.权利要求3或4所述基因的制备方法，是将ScFv基因和SPLUNC1基因按摩尔比1:1混合后稀释5倍(浓度为38.4ng/μL)作为模板，在正向引物：5’-CCGCGTGGATCCCCGGAATTCATGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3’和反向引物：5’-GTCGACTCGAGCGGCCGCATCTTAGACCTTGATGACAAACTGT-3’的引导下，PCR扩增得到ScFv-SPLUNC1融合基因；PCR反应体系为：EX Taq 0.25μL，10×EX Taq buffer 5μL，dNTP Mix 4μL，Fower Primer 2μL，Rewarse Primer 2μL Template 1μL，ddH₂O 35.75μL；PCR反应条件为：先预变性94℃3min，然后变性94℃30s，61℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃5min。

6.用于表达权利要求1或2所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达载体，是含有权利要求3或4所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因或权利要求5制备得到的ScFv-SPLUNC1融合基因的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的用于表达抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达载体，其特征在于：是将ScFv-SPLUNC1融合基因与线性化载体pGEX-4T-1进行连接得到的重组表达载体，命名为pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1。

8.权利要求7所述重组表达载体pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1的构建方法，包括以下过程：

1)、用ECOR1-HF和Sal-HF双酶切载体pGEX-4T-1得到线性化载体pGEX-4T-1；

2)、将ScFv-SPLUNC1融合基因与线性化载体pGEX-4T-1进行连接，连接体系为：线性化载体pGEX-4T-1 0.5μL(100ng)，ScFv-SPLUNC1融合基因0.5μL(200ng)，融合酶1μL，5×融合酶缓冲液2μL，用ddH₂O补充反应体系至10μL；连接条件为：37℃温浴30min，然后放在冰上冷却；

3)电泳回收并纯化条带产物得到携带ScFv-SPLUNC1融合基因的重组载体，命名为pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1。