[发明专利]高水平多路复用扩增

说明书

本公开内容提供了一种“环状扩增(looping amplification)”方法以增加核酸扩增的特异性。该增加的特异性将多路复用推进至比先前可能高得多的程度。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年12月16日提交的美国临时申请号62/268,263的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。

关于根据联邦政府资助的研究与开发进行的发明的权利的声明

不适用。

领域

本公开内容一般涉及核酸扩增的领域。特别地，本公开内容涉及可用于靶重测序(re-sequencing)的方法和组合物。

背景

靶重测序作为用于临床研究、临床试验和疾病诊断的重要工具而出现。然而，用于靶重测序的DNA文库制备仍然为非常具有挑战性的，遭受低靶覆盖率、低测序特异性和高成本。Fluidigm Corporation在Fluidigm Access系统上允许每个反应10个复用或每个样品480个复用，这提供了一个成本有效且易于使用的工作流程。在该工作流程中，多重测定需要芯片外(off-chip)条形码化和定制测序引物，以便与Illumina测序仪相容。由于引物二聚体形成和降低的测序特异性，基因组覆盖率受限于难以将多路复用水平增加至高于10-个复用。

概述

本公开内容描述了一种显著增加多路复用水平而不牺牲测序特异性的方法。该方法可以用于例如靶向的测序文库制备方法Fluidigm ACCESS系统来以低成本实现每个反应大于15,000个复用。凭借“芯片上(on-chip)”条形码化，甚至更多的“多路复用”是可能的，因为Fluidigm的芯片，诸如ACCESS ARRAY^TMIFC(Integrated Fluidic Circuit)，可以同时进行数千个反应。

本文考虑的多种实施方案可以包括，但不必限于以下实施方案中的一个或更多个：

实施方案1：一种用于扩增一种或更多种靶核酸的方法，所述方法包括：使样品核酸与用于每一种靶核酸的正向引物和反向引物接触，其中每一个引物包含靶特异性部分和靶特异性部分5’的共同序列；以及扩增所述靶核酸以产生至少一种靶扩增子，其中靶核苷酸序列在一个末端上侧翼为共同序列且在另一末端上为共同序列的反向互补序列，从而靶扩增子的单链可以形成茎环结构。

实施方案2：根据实施方案1所述的方法，其中多于一种(a plurality of)靶核酸被扩增。

实施方案3：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中多于一种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。

实施方案4：根据实施方案3所述的方法，其中多于10种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。

实施方案5：根据实施方案4所述的方法，其中至少100种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。

实施方案6：根据实施方案5所述的方法，其中至少1000种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。

实施方案7：根据实施方案6所述的方法，其中至少5000种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。

实施方案8：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中少于17,000种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。

实施方案9：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中所述共同序列包括转座子序列。

实施方案10：根据实施方案9所述的方法，其中所述转座子序列包含5’-AGATGTGTNNNAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:1)。