[发明专利]真正的胰腺祖细胞的分离

说明书

本发明涉及用于分离真正的胰腺祖细胞和富集细胞群体的真正胰腺祖细胞的方法。

发明领域

本发明涉及用于分离真正的胰腺祖细胞的方法。

发明背景

胰岛素依赖性糖尿病的细胞疗法治疗得利于不限数量的胰腺细胞的产生，所述胰腺细胞能够并且将能够发挥类似于人胰岛的作用。因此，需要生产衍生自人胚胎干(hES)细胞的这些胰腺细胞类型，以及纯化这些细胞的可靠方法。例如，使用衍生自人胚胎干细胞(hESC)的产生胰岛素的β细胞相比使用来自供体胰腺的细胞的当前细胞治疗方法将提供巨大的改善。目前，利用来自供体胰腺的细胞的糖尿病(例如1型或2型糖尿病)的细胞疗法治疗受限于移植所需的高质量胰岛细胞的稀缺。例如，针对单个1型糖尿病患者的细胞治疗需要移植大约8×10⁸个胰岛细胞(Shapiro et al,2000,N Engl J Med 343:230-238；Shapiro et al,2001a,Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 15:241-264；Shapiroet al,2001b,British Medical Journal 322:861)。因此，需要至少两个健康的供体器官来获得足够的胰岛细胞用于成功移植。

因此，胚胎干(ES)细胞代表了一个强大的模型系统，用于调查早期胚胎内多潜能细胞生物学和分化的机制，并为哺乳动物的基因操作和由此产生的商业、医疗和农业应用提供机会。此外，ES细胞的适当增殖和分化能够潜在地用于产生适合于移植的细胞的无限源，用于治疗由细胞损伤或功能障碍导致的疾病。也可以使用其他多能细胞和细胞系，包括早期原始外胚层样细胞(EPL)，体内或体外衍生的ICM/上胚层，体内或体外衍生的原始外胚层，原始生殖细胞(EG细胞)，畸胎癌细胞(EC细胞)以及通过去分化或核移植衍生的多能细胞。

因此，需要用于分离真正的胰腺祖细胞的方法。

发明概述

本发明提供了用于分离表达PDX1和NKX6.1的真正的胰腺祖细胞的方法。本发明的方法基于使用对表达PDX1和/或NKX6.1的细胞特异性的标志物或使用特异于不表达PDX1的细胞的标志物。还提供了通过这样的方法能够获得的细胞群体，以及它们用于治疗代谢紊乱的用途。

附图说明

图1.eGFP靶向进入人PDX1基因座。A)将编码绿色荧光蛋白(eGFP)的基因插入到hPS细胞系HUES-4中的PDX1基因的5'非翻译区(UTR)中。BD引物扩增WT等位基因，AC引物扩增所有转基因克隆，AD引物扩增所靶向的等位基因(3'HA)。B)针对4个个体克隆(泳道1和4：基因靶向阳性克隆；泳道2)，使用Neo/F和Ex3/R引物显示4个靶向事件的代表性PCR筛选(片段大小5.1kb)。使用整合到PDX1基因座中的包含报道子盒的PDX1eGFP BAC作为阳性对照(BAC)。C)显示在3种不同的hPS细胞系中获得的相对靶向效率的表格。D)显示在第13天所靶向的PDX1-eGFP hES细胞系的荧光和相应的相差图像。比例尺＝100μm。E)在第16天PDX1-GFP靶向细胞系的免疫荧光图像，其显示内源性PDX1表达(红色)与GFP(绿色)的共定位。比例尺＝50μm。F)第17天的PDX1-eGFP+细胞群体的免疫荧光分析。显著数目的GFP+/PDX1+细胞共表达NKX6-1和SOX9。大部分PDX1+细胞也表达ECAD和HES1(数据未显示)。比例尺＝50μm。

图2.体外分化的PDX1-eGFP hPSC的分析。