[发明专利]用于增加单体抗体FAB-DSFV多聚体种类的百分比的方法

说明书

本发明提供了用于提高重组表达的抗体分子的组合物中单体百分比的方法，其特征在于所述抗体分子包含至少一个对目标抗原具有特异性的Fv，所述Fv包含一个VH和一个VL，其中所述VH和VL通过一个或多个接头间接连接或直接连接并且通过其间的二硫键稳定，所述方法包括：a)将包含抗体分子的组合物在30至60℃的温度范围内保持至少1小时时间段的热转化步骤，其中步骤a)在还原剂存在下或在用还原剂处理后进行。

本公开内容涉及用于增加重组表达的抗体分子的组合物中单体的量的方法和由本文所述的方法获得或可获得的组合物。

治疗性单克隆抗体已成为非常重要的一类治疗剂。如WO2010/019493中所公开的，纯化和配制这些抗体分子是一个挑战。然而，非常重要的是只有最高质量的材料被用于治疗应用。随着新颖和复杂的抗体构建体被产生为治疗剂，例如双特异性形式，这变得更加困难。

新的抗体形式通常需要存在包含可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)的至少一个Fv区域，其中可变结构域不处于其在C端连接至恒定轻链结构域(CL)或恒定重链结构域(CH1)的天然状态。在天然存在的完整抗体分子中，CL和CH1结构域的存在起到稳定VL和VH的配对的作用。因此，在不存在CL和CH1结构域的情况下，可变结构域倾向于与相邻分子的可变结构域进行动态交换。阻止这种动态过程的一种方法是在V_H和V_L之间引入二硫键，其锁定v区配对并防止动态交换。然而，二硫键的存在也可以起到稳定不想要的抗体多聚体的作用。

新的抗体形式通常还包含接头。然而，当一个分子中的可变结构域与另一个分子中的可变结构域配对，从而将两个分子连接在一起时，接头的存在可能导致形成不想要的多聚体。Fv中二硫键的存在然后起到稳定多聚体种类的作用。

已知的双特异性抗体形式的实例是WO2010/035012和WO2011/036460中详细描述的Fab-dsFv。如图27所示，该抗体形式具有形成包含两个或更多个单体的多聚体的倾向。类似的多聚体种类也存在于包含二硫键合的scFv分子的组合物中，其中来自一个scFv的VH与来自单独的scFv的VL配对以形成二硫化物稳定的Fv对，其将两个scFv分子连接在一起从而导致两个scFv的二聚体。单独分子中的可变结构域的进一步配对可以产生更大的多聚体种类。

已知的纯化方法如色谱法能够从较小的单体种类中分离出大的多聚体种类，但是这不可避免地导致抗体的总产率较低。因此，对于双特异性抗体形式，非常需要解决抗体组合物中不想要的多聚体种类的问题的方法。

本公开内容的方法通过减少包含抗体分子的组合物中多聚体的量来提供对上述问题的解决方案。本公开内容对于提供适用于人类使用的单体单克隆抗体分子的组合物特别有用。

因此，提供了用于增加重组表达的抗体分子的组合物中单体百分比的方法，其特征在于所述抗体分子包含至少一个对目标抗原具有特异性的Fv，所述Fv包含一个VH和一个VL，其中所述VH和VL通过一个或多个接头间接连接或直接连接并通过其间的二硫键稳定，所述方法包括：

a)将包含抗体分子的组合物在30至60℃的温度范围内保持至少1小时时间段的热转化步骤，

b)其中步骤a)在还原剂存在下或在用还原剂处理后进行。

将本文所述的方法用于重组表达的抗体有利地增加了组合物中单体的量。有利地，本文的方法可以容易且成本有效地在商业规模上使用。

本发明的方法能够将多聚体种类转化成单体，由此增加单体的百分比。转化步骤有利地允许还原剂还原VH和VL之间和多聚体种类的二硫键以部分变性并由此分解多聚体。该方法还允许VH和VL结构域在单个抗体分子内形成Fv对，以及VH和VL之间稳定的二硫键的重新形成从而导致单体。发明人已经令人惊讶地显示转化步骤和还原剂可用于将抗体多聚体转化为抗体单体，而不完全变性抗体。本发明的方法还有利地允许正确的二硫键被重新形成以产生期望的单体。