[发明专利]用于次要等位基因和多态性的鉴定和定量的多重化方法

权利要求书

1.一种用于非诊断目的的鉴定样品中一种或多种次要核酸物质的存在或不存在的多重化方法，所述样品包括所述一种或多种靶核酸，其中所述方法包括：

（a）同时扩增所述样品的靶核酸，其中各靶核酸具有主要核酸物质和一种或多种次要核酸物质，其中各次要核酸物质是主要核酸物质的低频率或低拷贝数变体；

（b）在包括对于一种或多种主要核酸物质特异的链终止剂和一种或多种对于一种或多种次要核酸物质特异的链终止剂的延伸条件下使（a）的扩增的核酸与一种或多种延伸引物接触，其中：

（i）一种或多种主要核酸物质共有对于主要核酸物质特异且对次要核酸物质非特异的共同链终止剂，

（ii）一种或多种次要核酸物质中的每一种具有对于次要核酸物质特异并且对于主要核酸物质非特异的链终止剂，其中对于次要核酸物质特异的链终止剂：（A）对于扩增的核酸中的特定次要核酸物质是独特的，并且不被扩增的核酸中的其他次要核酸物质所共有，或（B）一种或多种次要核酸物质中的至少一种与扩增的核酸中的至少一种其他次要核酸物质共有共同的链终止剂，和

（iii）对于主要核酸物质特异的链终止剂的浓度小于对于一种或多种次要核酸物质特异的每种链终止剂的浓度，

由此引物延伸到相对于主要核酸物质的次要核酸物质中不同的核苷酸位置或通过其中，从而产生分别对应于所述样品中存在的次要核酸物质和主要核酸物质的链终止的延伸产物；和

（c）分析（b）的延伸产物，从而鉴定一种或多种次要核酸物质的存在或不存在，

其中所述一种或多种次要核酸物质各自以主要核酸物质的频率或拷贝数的0.25％至小于10％，或0.5％至小于10％，或1％至小于10％的频率或拷贝数存在，或者所述一种或多种次要核酸物质代表少于主要核酸物质的30％，20％，15％，10％，8％，5％，4％，3％，2％，1％，0.8％，0.75％，0.5％，0.1％，0.05％或0.01％，并且

其中对于主要核酸物质特异的链终止剂的浓度为每个针对次要核酸物质特异的链终止剂的浓度的1％至20％，或0.1％至10％，或0.01％至5％。

2.如权利要求1所述的方法，其中核酸样品包括多种次要核酸物质，其是单一主要核酸物质的变体，并且在单一多重化反应中鉴定所述多种次要核酸物质。

3.如权利要求1所述的方法，其中核酸样品包括多种主要核酸物质，其各自具有一种或多种次要核酸物质，并且所述次要核酸物质在单一多重化反应中鉴定。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括在（c）中鉴定一种或多种主要核酸物质的存在或不存在。